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马氏珠母贝精子质量检测方法的研究

豆伟

  本文选用台盼蓝及荧光染料对马氏珠母贝(Pinctada martensii)精液进行染色,通过显微镜观察比较染色效果,筛选出适宜马氏珠母贝精子质量检测的染色方法,使之应用于其精子质量评价中所需的精子活率、质膜完整性和DNA完整性等指标的检测中,也为贝类精子的质量检测提供最基础的参考数据。 1、台盼蓝染色法检测马氏珠母贝活精率的研究 本文采用台盼蓝染色法对马氏珠母贝活精率进行了检测。结果显示,经台盼蓝染色后,在显微镜下可以明显区分死活精子。活精子不着色,呈透明状;死精子变大着蓝色。通过对该染料不同的染色浓度和染色时间的比较得出,台盼蓝最适的染色浓度为0.2 %(终浓度)、染色时间为15 min。 配制含有不同死亡率的9个样品(10~90 %)作为理论死亡率,用0.2 %的台盼蓝和0.04 %曙红Y(终浓度)同时检测上述各样品。结果显示,两种染料检测得出实际死亡率与理论死亡率呈极显著正相关(P<0.01),同时两种染色方法的结果之间亦呈极显著正相关(P<0.01)。 用台盼蓝和曙红Y检测了染料对精子的毒性作用以及室温(28℃)放置下精子的自然死亡率。结果显示,当达到一定时间积累后,两种染料对精子都有一定的毒性作用,但是在45 min之内,毒性作用不明显。 上述各实验结果表明,用0.2 %的台盼蓝染色15 min可准确、可靠的检测马氏珠母贝精子的存活率,能较真实的反映精子的状态。 2、二乙酰荧光素(Fluorescein diacetate, FDA)-碘化丙锭(Propidium iodide, PI)双荧光复染法检测马氏珠母贝精子活精率的研究 本文通过两种荧光染料FDA和PI的联用在荧光显微镜下检测马氏珠母贝精子的活率。通过不同的染色浓度和染色时间的比较发现,FDA和PI的最适染色浓度均为10 ug/mL,染色时间控制在10 min之内为宜。 用新鲜精液和水浴致死的精液配制含有不同死亡率的5个样品(0 %、20 %、40 %、60 %和80 %),作为理论死亡率,用FDA和PI测定各样品精子的死亡率,并进行相关性分析。结果显示,荧光探针FDA和PI能分别标记活精子和死精子,活精子发出绿色荧光,死精子发出红色荧光。各样品实测精子死亡率和理论死亡率之间呈极显著正相关(P<0.01)。且染料FDA和PI加入精液的顺序对精子存活率的检测结果没有影响(P>0.05);表明FDA-PI双荧光复染法是一种灵敏度高、重复性好、准确有效的检测马氏珠母贝精子存活率的实验室方法。 用FDA和PI检测了超低温冷冻前后精子的活精率。结果显示,精液经超低温冷冻后精子的存活率明显降低(P<0.01),质膜受到不同程度的损伤。同时探讨了不同的冷冻保存体积对马氏珠母贝精子存活率的影响,结果显示,体积过大或过小都会影响精子的存活率,冷冻时最佳的保存体积为1.2-1.6 mL。 3、吖啶橙(Acridine Orange, AO)染色法检测马氏珠母贝精子DNA的完整性 本文用AO染色来检测马氏珠母贝精子DNA的完整性。结果显示,精液经AO染色后,在荧光显微镜下可观察到发出绿色荧光、红色荧光或橘黄色荧光的精子,其中发绿色荧光的精子DNA双链结构完整,发红色或橘黄色荧光的精子DNA双链已受到不同程度的损伤,DNA双链结构已断裂为单链。通过不同染色浓度和时间的比较发现,最适的AO染色浓度为200 ug/mL,染色时间为5 min。在此基础上,用AO染色法检测评价超低温冷冻前后精子DNA的完整性。结果显示,冷冻对精子的DNA双链结构会有不同程度的损伤。……   
[关键词]:马氏珠母贝;精子;存活率;质膜完整性;DNA完整性
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:广东海洋大学2011年