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农产品中两种真菌毒素蛋白质芯片检测技术的研究

王希春

  真菌毒素是一类由不同真菌产生的次级代谢产物,广泛污染各种农产品和饲料,它不仅降低产品质量,带来严重的食源性中毒问题,而且可以引起人和动物的急慢性中毒,如免疫抑制、组织坏死、肝肾损伤、繁殖障碍、致癌致畸等病理变化,从而影响人和动物的身体健康,在全球食品安全中受到高度关注。近年来,真菌毒素的检测技术得到了不断发展,常见的有气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)及酶联免疫吸附法(ELISA)等。色谱分析法虽然检测灵敏度高,可是样品前处理繁琐、操作复杂,在实际应用中较难普及;而ELISA方法具有敏感、特异、稳定、简便的优点,非常适合真菌毒素的检测,但每次只能检测一种真菌毒素。由于现实中农产品往往不是受一种真菌毒素污染,而是同时受多种真菌毒素污染,因此,具有微型化、高通量优点的蛋白质芯片技术成为多种真菌毒素同时快速检测的发展趋势。本试验针对农产品中常见的、危害性较大的赭曲霉毒素A (OTA)与伏马菌素B1(FB1)为研究对象,通过完全抗原的制备,以单克隆抗体技术为支撑,采用间接竞争的检测原理,以荧光作为检测信号,对真菌毒素多元检测的蛋白质芯片进行了探索。 试验Ⅰ赭曲霉毒素A完全抗原的制备与检测 为了制备蛋白质芯片用探针,本试验采用活性酯法对OTA与卵清蛋白(OVA)进行偶联。取2 mg OTA溶解于0.5 mL无水四氢呋喃(THF)中,再分别加入2 mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、3 mg N, N-二环己基碳化二亚胺(DCC),于室温下振荡反应24 h进行活化,离心,取上清,弃沉淀;将上清液真空干燥,其活化产物残留物溶于0.5 mL二甲基甲酰胺(DMF)中。将上述溶液缓慢滴加于载体蛋白OVA溶液中,振荡反应4 h,于PBS溶液中4℃透析72 h。透析液经PEG 20000浓缩后,进行蛋白质含量测定。对于偶联后的完全抗原分别进行紫外扫描、质谱分析和蛋白质芯片检测。紫外扫描显示,偶联物与OTA和OVA的波型不同,发生了明显的位移,可初步判断偶联成功。根据紫外扫描可分析OTA与OVA的连接比,在280 nm和379 nm的波长下,所测A值分别为0.389和0.875,得出OTA与OVA的连接比为10:1;根据质谱分析偶联物的分子量为50350.141,可计算出偶联比为13:1。同时蛋白质芯片检测结果显示,偶联物与OTA McAb之间发生了特异性反应,提示完全抗原的存在。通过测定,偶联物的蛋白质浓度为1.28 mg·mL-1。 试验Ⅱ伏马菌素B1完全抗原的制备与检测 为了制备蛋白质芯片用探针,本试验采用戊二醛一步法对FB1与载体蛋白OVA进行偶联。取1.2 mg的OVA,用PBS溶液配制蛋白质悬浮液,浓度为1 mg·mL-1,在磁力搅拌中用蛋白质悬浮液溶解1 mg FB1,并逐滴加入相同体积的戊二醛(2%,V/V),室温反应1 h,用硼氢化纳终止反应,使硼氢化纳的终浓度为10 mg·mL-1,室温反应1 h。最后,在磁力搅拌条件下用PBS于4℃透析72 h。透析液经PEG20000浓缩后,进行蛋白质含量测定。偶联后的完全抗原分别进行紫外扫描、质谱分析和蛋白质芯片检测。紫外扫描显示,偶联物与OVA的波型不同,可初步判断完全抗原的存在。根据质谱分析偶联物的分子量为51928.612,可计算出FB1与OVA的偶联比为9.6:1。同时蛋白质芯片检测结果显示,偶联物与FB1 McAb之间发生了特异性反应,提示偶联是成功的。通过测定,偶联物的蛋白质浓度为1.08 mg·mL-1。 试验Ⅲ真菌毒素蛋白质芯片的制备与条件优化 本试验分别采用腹水制备技术和饱和硫酸铵沉淀法进行了OTA和FB1 McAb的大量制备和纯化。首先复苏两种杂交瘤细胞,进行培养。选取20只BALB/c雌性小鼠,注射灭菌液体石蜡,每只0.5 mL,1~2周后注射杂交瘤细胞悬液,每只0.5 mL,接种量为5×105个细胞。试验期间,每天观察小鼠的生长情况,经过10 d左右,待小鼠腹部膨大时,无菌收集腹水。收集到的腹水采用饱和硫酸铵沉淀法进行纯化,通过蛋白质含量测定,两种单克隆抗体的浓度分别为1.6 mg·mL-1和1.2 mg·mL-1。 分别对OTA与FB1完全抗原点样浓度、单克隆抗体稀释比例进行确定以及完全抗原固定条件、封闭液、封闭时间、抗原抗体反应时间和羊抗鼠IgG-CY3二抗浓度五个单因素进行优化。结果显示,OTA和FB1完全抗原最佳点样浓度为30μg·mL-1,和40μg·mL-1单克隆抗体的稀释比例为1:1600和1:1200。同时确定4℃过夜固定、0.1%BSA封闭液、37℃封闭1 h、抗原抗体反应1 h和2μg·mL-1羊抗鼠IgG-CY3二抗为五个单因素的最佳实验条件。以OTA与FB1标准品分别进行间接竞争抑制试验,制定OTA与FB1蛋白质芯片检测的标准曲线,灵敏度(IC50)分别为2.1 ng·mL-1和41.5 ng·mL-1,线性检测范围分别为0.5~10 ng·mL-1和10~200 ng·mL-1,线性相关系数(R2)分别为0.9934和0.9926,线性关系良好。 试验IV蛋白质芯片与HPLC检测方法的比较 在OTA与FB1蛋白质芯片检测的基础上,进行同时检测两种真菌毒素蛋白质芯片的研究,以OTA和FB1标准品同时进行间接竞争抑制试验,制定同时检测OTA和FB1蛋白质芯片的标准曲线,灵敏度(IC5o)分别为0.795 ng·mL-1和20.1ng·mL-1 ,线性检测范围分别为0.1~5 ng·mL-1和6.25~100 ng·mL-1,线性相关系数(R2)分别为0.9931和0.9917。通过样品的加标检测,最低检测限分别为0.5μg·kg-1和12.5μg·kg-1, OTA标准品浓度为1、5、10μg·kg-1时,其平均检出量分别为0.82、4.34和8.24μg·kg-1,最高回收率达到86.7%,变异系数均小于10%;FB1标准品浓度为20、50、100μg·kg-1时,其平均检出量分别为16.46、44.75和85.72μg·kg-1,最高回收率达到89.5%,变异系数均小于10%,线性关系良好。 建立了OTA与FB1的HPLC检测方法,并制定相应的标准曲线,两种毒素的检测范围分别是1~100 ng·mL-1和0.1~20μg·mL-1,线性相关系数(R2)均为0.9999。通过样品的加标检测,最低检测限分别为1μg·kg-1和50μg·kg-1, OTA标准品浓度为5、10、50μg·kg-1时,其平均检出量分别为3.76、9.08和43.2μg·kg-1,最高回收率达到90.8%,变异系数均小于10%;FB1标准品浓度为50、100、500μg·kg-1时,其平均检出量分别为37.5、84.5和411.5μg·kg-1,最高回收率达到84.5%,变异系数均小于10%,线性关系良好。 针对南京地区收集的玉米、小麦和大米等46份样品,经过提取、净化后,分别采用蛋白质芯片与HPLC检测样品中OTA和FB1含量。蛋白质芯片检测结果显示,玉米样品中两种毒素OTA和FB1的含量偏高,最高值分别为9.58μg·kg-1和469μg·kg-1,3种样品(玉米、小麦和大米)中两种毒素的平均检出率分别为23.4%和29.8%; HPLC检测结果显示,玉米样品中两种毒素的含量分别为9.75μg·kg-1和438μg·kg-1,3种样品中两种毒素的平均检出率分别为19.3%和21.2%。通过比较,两种方法样品中毒素最高含量值相近,但样品中OTA和FB1 HPLC法的检出率低于蛋白质芯片。以上结果说明蛋白质芯片在线性范围内可用于农产品中这两种毒素的同时检测。……   
[关键词]:真菌毒素;完全抗原;单克隆抗体;蛋白质芯片;高效液相色谱法
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:南京农业大学2010年
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