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堆型艾美耳球虫乳酸脱氢酶DNA疫苗免疫保护作用及免疫机理研究

宋鸿雁

  鸡球虫病是由艾美耳属(Eimeria)球虫寄生于鸡肠上皮细胞内所引起的寄生虫病,分布于世界各地,对养禽业危害巨大。由于目前的药物预防、活疫苗接种等防控措施存在较多问题,因此,有必要研究新的防控手段。DNA疫苗可以诱导宿主产生长期的体液免疫和细胞免疫,预防包括球虫病在内的多种疾病,因此成为疫苗发展的新方向。已经有多种球虫保护性抗原如EtMICs、SO7、5401、cSZ-1、3-1E等被发现,其保护效果也已经被大量的研究所证实。研究发现,堆型艾美耳球虫(E. acervulina)乳酸脱氢酶(LDH)是相对分子质量为37 kDa的蛋白,在球虫发育的4个阶段(卵囊、子孢子、裂殖体和裂殖子)均有相似水平的表达,可对E. acervulina的攻击产生部分保护力,被认为是一种很有潜力的疫苗候选抗原。 本研究利用RT-PCR方法从E. acervulina第一代裂殖体克隆了E. acervulina LDH基因,酶切及PCR鉴定均正确的菌株经测序,结果显示,克隆片段含一个长993 bp的开放阅读框(ORF),编码330个氨基酸,与GenBank上的E. acervulina LDH基因序列相似性为98%。应用DNA重组技术,将LDH基因克隆到原核表达载体pET28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),通过IPTG诱导表达重组LDH蛋白。SDS-PAGE电泳显示,pET28a(+)-LDH在大肠杆菌中得到成功表达,其分子量在41 kDa左右。菌体经超声破碎后的沉淀与上清的SDS-PAGE分析结果表明,重组蛋白主要以包涵体形式存在。 本研究利用DNA重组技术,分别构建pVAX-LDH、pVAX-LDH-IFN-γ和pVAX-LDH-IL-2 DNA疫苗。经鉴定正确后,分别用重组质粒免疫14日龄雏鸡,1周后取肌肉注射部位、非注射部位组织和pVAX1空质粒注射部位,用RT-PCR和western blot检测疫苗的转录和表达情况。结果表明,构建的DNA疫苗均能在注射部位肌肉成功转录和表达。 将构建的DNA疫苗pVAX-LDH、pVAX-LDH-IFN-γ和pVAX-LDH-IL-2以及LDH重组蛋白和包涵体经腿部肌肉分别于14、21日龄两次免疫雏鸡,并设立感染非免疫和非感染非免疫对照组,另设pVAX1空质粒注射组。除非感染非免疫组外,28日龄经口接种新鲜的E. acervulina孢子化卵囊,攻虫第6天宰杀全部实验动物,计算存活率、进行病变记分、增重、卵囊下降率,通过计算综合抗球虫指数(ACI)这些生理指标,评价构建的疫苗对鸡抗球虫保护力。结果表明,所构建的重组质粒对感染球虫鸡均具有一定的保护效果,其中以pVAX-LDH-IFN-γ和pVAX-LDH-IL-2重组质粒组保护效果最好。 用构建的3种DNA疫苗免疫14日龄雏鸡,并设灭菌水注射和pVAX1空质粒对照组。21日龄以同样剂量加强免疫一次,二免后第7天,取鸡脾脏分离淋巴细胞。采用MTT法测定脾脏淋巴细胞增殖反应。结果发现,DNA疫苗免疫后鸡脾脏淋巴细胞增殖水平均显著高于灭菌水和pVAX1空质粒对照组。说明构建的DNA疫苗可以刺激鸡体的免疫系统尤其是细胞免疫反应。 用构建的3种DNA疫苗免疫14日龄雏鸡,并设灭菌水注射和pVAX1空质粒对照组,21日龄以同样剂量加强免疫一次。分别于首次免疫后第7天和第2次免疫后第7天取鸡脾脏和盲肠扁桃体分离淋巴细胞,用带有荧光标记的CD3+、CD4+、CD8+单克隆抗体进行荧光染色,用流式细胞术检测CD3+、CD4+/CD3+、CD8+/CD3+的比例。结果发现,第1次免疫后第7天脾脏和盲肠扁桃体中各组间CD3+ T淋巴细胞水平差异均不显著(P>0.05),第2次免疫后第7天,DNA疫苗组CD3+水平显著高于灭菌水和pVAX1空质粒组(P<0.05)。结果表明,构建的DNA疫苗可以增强鸡体T淋巴细胞反应。 用构建的3种DNA疫苗免疫14日龄雏鸡,并设灭菌水注射和pVAX1空质粒对照组,21日龄以同样剂量加强免疫一次。二免后第7天,取鸡脾脏和盲肠扁桃体分离淋巴细胞。提取淋巴细胞总RNA,反转录合成cDNA,进行实时荧光定量PCR,检测脾脏和盲肠扁桃体中IFN-γ、IL-2、IL-4、TNFSF15、IL-17D和TGF-β4 mRNA水平变化,以GAPDH为内参照,采用2-ΔΔCT方法计算各细胞因子相对mRNA表达量。结果发现,疫苗免疫后鸡脾脏和盲肠扁桃体IFN-γ、IL-2、TNFSF15、IL-17D和TGF-β4 mRNA水平显著升高,表明.,本研究构建的DNA疫苗可以促进鸡体内细胞因子分泌。 用构建的3种DNA疫苗免疫14日龄雏鸡,并设灭菌水注射和pVAX1空质粒对照组,21日龄以同样剂量加强免疫一次。1周后心脏采全血,制备血清,之后每间隔1周心脏采血,一直采样到二免后第6周。用重组LDH蛋白作为包被抗原,采用间接ELISA方法,检测血清样品的IgG水平。结果发现:二免后1~6周,疫苗组显示了显著高于灭菌水和pVAX1空质粒组的特异性LDH抗体水平。pVAX-LDH-IFN-γ组和pVAX-LDH-IL-2组的抗体滴度比pVAX-LDH高,且差异显著。pVAX-LDH-IL-2组在3个疫苗组中表现最高的抗体滴度。在整个过程中,注射灭菌水和pVAX1空质粒的两个组均未检测到特异性的抗体。结果表明,构建的DNA疫苗可以诱导鸡体产生特异性抗体。 本研究通过动物保护性试验和免疫机理研究结果证实,构建的DNA疫苗可以刺激机体产生显著的全身和局部免疫反应,诱导机体产生细胞免疫和体液免疫共同参与抵抗球虫感染,为机体提供一定保护力。……   
[关键词]:堆型艾美耳球虫;LDH基因;DNA疫苗;T细胞亚类;抗体水平;细胞因子
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:南京农业大学2010年