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解淀粉芽孢杆菌C06防治桃褐腐病菌的机制及其产生的γ-多聚谷氨酸在定殖中的作用

刘俊

  芽孢杆菌菌株C06具有很强的水果采后保鲜的潜力,通过Bio-log、16S ribosomal RNA和BOX-PCR等方法鉴定该菌株属于解淀粉芽孢杆菌。C06能够防治Monilinia fructicola引起的桃褐腐病,将桃子的货架期从3天延长到7天;用该菌株的发酵上清液直接处理桃褐腐病菌可以抑制桃褐腐病菌孢子的萌发和菌丝的生长,表明C06的发酵上清液中含有抑病桃褐腐病菌的物质。另外,解淀粉芽孢杆菌C06还以在平板上形成粘性的菌落并向培养基中分泌粘性物质。本研究主要分为三个方面:1,鉴定C06上清液中的抑菌物质;2,鉴定C06向细胞外分泌的粘性物质及其在定殖中的作用;3,筛选高产胞外粘质的突变体并分析高产的机理。主要研究结果如下: 1.以解淀粉芽孢杆菌C06的酶切基因组为检测子,以枯草芽孢杆菌168的酶切基因组为驱动子,进行差减杂交(subtractive suppressed hybridization, SSH),克隆C06中的特异基因。本研究共得到43段特异的DNA序列,其中有三个DNA片段分别与脂肽类化合物bacilloymcin D和fengycin的合成酶基因具有很高的同源性。本研究采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析技术检测解淀粉芽孢杆菌C06发酵液中的抑菌物质,发现野生型的C06能够产生两种脂肽类化合物bacilloymcin D和fengycin。根据SSH得到的bmyC和fenD片段,构建突变体C06AbmyC和C06AfenD,根据FZB42中的sfp的基因序列构建突变体C06Δsfp。sfp基因编码4 -磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(4 -phosphopantetheinyl transferase),是非核糖体途径合成脂肽类化合物的关键基因。用质谱技术检测C06Δsfp、C06AbmyC和C06ΔfenD的发酵上清液,结果显示,C06Δsfp不产生任何的脂肽类化合物;C06AbmyC和C06AfenD分别丧失合成bacillomycin D和fengycin的能力。分别用C06、C06ΔbmyC、C06AfenD和C06Δsfp的发酵上清液处理桃褐腐病菌的孢子和菌丝,结果显示,C06Δsfp丧失抑制孢子萌发和菌丝生长的能力,表明脂肽类化合物是C06主要的抑菌物质;C06ΔbmyC具有与野生型C06相似的抑制菌生长的能力,而C06AfenD抑制菌丝生长的明显弱于C06AbmyC,表明fengycin是C06主要的抑制菌丝生长的次生代谢物;C06AbmyC和C06AfenD都能很好的抑制桃褐腐病菌的孢子萌发,表明在C06抑制孢子萌发的过程中fenycin和bacillomycin D都很重要。 2.解淀粉芽孢杆菌C06具有向胞外分泌粘性物质的能力。本研究通过构建解淀粉芽孢杆菌C06的突变体文库,筛选到四个不产粘质的突变体M105、M106、M107和M1080。Southern blot结果显示,M105是多拷贝插入的转座突变体,M106、M107和M108是单拷贝插入的突变体。用M106、M107和M108进行反向PCR分析,结果显示在M106和M107中,转座子插入位点都是ywsC;在M108中,转座子插入为位点是comA。ywsC编码γ-多聚谷氨酸(γ-PGA)合成酶;comA是调控基因,可以正向调控ywsC的合成。进一步用薄层层析、液相色谱和紫外扫描三种方法分析粘性物质的性质,结果显示粘质的分子量在300-3000kDa,粘质的水解产物是谷氨酸、且在260nm和280nm处没有特异性的吸收峰,证明该物质是由谷氨酸通过非肽键连接而成的多聚物——γ-PGA。本研究通过比较野生型的C06与不产y-PGA的突变体M106和C06ΔywsC,发现野生型C06在生物膜形成能力、群集运动能力和表面吸附能力三个方面都强于突变体,这可能是因为γ-PGA具有很强的粘性、可以吸附大量的阳离子,增强菌体之间的聚集能力和菌体与基质表面的吸附能力。生防细菌在植物根部和果实表面的定殖通常经过三个步骤:(1),以游动态细胞的形式吸附在植物的表面;(2),形成微菌落;(3),通过群集运动扩展菌落。由此推测,γ-PGA可以促进生防菌在活体上的定殖能力,实验结果显示野生型的C06-MA在苹果表面的定殖能力明显强于C06AΔyvsC。本研究还重点研究了EPS(胞外多糖)、TasA(胞外蛋白)和γ-PGA与生物膜形成的关系。结果显示,在仅产生γ-PGA的条件下,芽孢杆菌无法形成具有复杂空间结构的菌落;而在γ-PGA与胞外多糖或TasA蛋白共同作用下,芽孢杆菌可以形成菌落,但是其结构的复杂度低于三者共同作用的结果。 3.在筛选突变体文库的过程中,我们还得到一株生物膜形成缺陷突变体M306。色谱检测结果显示,M306的γ-PGA的产量是野生型的两倍。Southern blot和反向PCR的结果显示,TnYLB-1转座子在M306中是单拷贝的,且插入位点在RBAM_034450和phrF之间。Quantative RT-PCR (qRT-PCR)分析结果显示,与野生型的C06相比,M306中phrF的表达水平没有明显变化,而RBAM_034450的表达水平下降明显,证明M306的突变表型是由RBAM_034450的突变引起的。RBAM_034450是转录调控蛋白,可以受到逆境环境的诱导,调控下游基因的表达。定点突变RBAM_034450,构建突变体C06ARBAM。用qRT-PCR分析C06ΔRBAM和M306相关基因的表达,结果显示与野生型C06相比,C06ΔRBAM和M306的生物膜形成关键基因epsD(胞外多糖合成酶基因)和yqxM (TasA合成分泌基因)的表达水平明显下降,而ywtB (y-PGA合成酶基因)的表达没有明显变化。构建C06的胞外多糖合成突变体C06ΔespA和TasA蛋白合成突变体C06ΔtasA,检测突变体γ-PGA的产量,发现C06ΔespA的产量与M306相近,明显高于野生型;而C06ΔtasA的产量与野生型没有明显差别,证明在突变体M306中γ-PGA的高产是由于胞外多糖合成酶基因下调表达间接导致。胞外多糖的合成与γ-PGA的合成都可以利用三羧酸循环的中间产物为底物;当胞外多糖的合成途径被破坏后,可以增加γ-PGA底物的供应,从而提高γ-PGA的产量。……   
[关键词]:解淀粉芽孢杆菌C06;脂肽化合物;桃褐腐病菌;定殖;γ-多聚谷氨酸(γ-PGA);pbrA
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:南京农业大学2010年
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