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盐胁迫诱导水稻根尖细胞质膜蛋白差异表达及LRR型受体蛋白激酶的功能研究

程彦伟

  以粳稻推广品种徐稻三号为实验材料,通过两相分配法提取根尖细胞高纯度质膜,并利用IEF/SDS-PAGE双向电泳和SDS-PAGE单向电泳对盐胁迫下质膜蛋白质组进行了比较研究,结合MALDI-TOF/TOF和LC-MS/MS质谱分析,鉴定了质膜蛋白质组中的胁迫响应蛋白;然后利用实时定量PCR对鉴定的蛋白质在转录水平的变化进行了分析;在此基础上,对其中一个LRR型受体蛋白激酶N末端片段进行原核表达,制备了该蛋白的多克隆抗体,通过免疫印迹(Western blot)、免疫组化(Immunohistochemistry)、免疫电镜(Immunoelectron microscopy)和免疫共沉淀(Immunoprecipitation)对该蛋白的功能进行了分析,主要内容如下: 1.盐胁迫下水稻根尖质膜蛋白质组和相关转录组研究 150mM NaCl处理水稻水培根尖发现盐胁迫48h显著抑制根的生长。取盐胁迫48h水稻根尖,利用葡聚糖-聚乙二醇两相分配法纯化得到纯度接近90%的质膜组分,IEF/SDS-PAGE双向电泳分析,发现34个蛋白点在盐处理后的表达有显著差异(>1.5倍),其中16个蛋白点上调,18个蛋白点下调。MALDI-TOF/TOF质谱鉴定表明这些差异蛋白大多数是膜相关蛋白,涉及很多重要的生理过程:(1)膜稳定性,包括参与细胞和膜骨架形成的remorin;细胞壁骨架连接的肌球蛋白重链相关蛋白;参与跨膜物质运输的α-可溶性NSF附着蛋白等。(2)离子动态平衡,包括参与了液泡膜电化学梯度和离子运输的V-ATPase E亚基和putative YLP;参与钾离子通道控制的超敏诱导蛋白;调节质膜H+-ATPase活性和离子通道(K+外排)控制的14-3-3蛋白等。(3)信号转导,例如参与Ca2+信号转导途径的钙调素和DREPP蛋白;参与环境胁迫信号转导的LRR(Leucine Rich Repeat)型受体蛋白激酶等。为了分析质膜上多次跨膜蛋白,利用高盐(0.6 M KC1)和温和去污剂(15 mM CHAPS)对纯化的质膜进行洗涤,以降低质膜组分的复杂程度,然后通过SDS-PAGE单向电泳分离和LC-MS/MS质谱分析,鉴定了多个疏水性较强的多次跨膜蛋白:如参与细胞水分调控的水通道蛋白aquaporinPIP2.2,参与膜结构稳定性维持和膜运输的annexin,参与质膜跨膜电势形成和物质运输的H+-ATPase和参与囊泡运输的Rab11C等。在此基础上,利用实时荧光定量PCR对双向电泳和SDS-PAGE分离鉴定的部分蛋白进行转录水平的研究,发现有5种蛋白转录水平和蛋白水平变化一致(putative remorin 1 protein, putative receptor proteinkinase, hypersensitive-induced response protein,14-3-3 like protein和cytochrome b5),3种蛋白转录水平和蛋白水平变化不一致(Calmodulin, putative alpha-soluble NSF attachment protein和putative YLP).研究结果表明高等植物中基因表达存在转录水平和翻译水平的差异,推测这种差异和mRNA、蛋白质各自的修饰及稳定性有关。 2.水稻LRR型受体蛋白激酶胞外区的原核表达、抗体制备和生物功能分析 上述组学研究发现了一个新的水稻LRR型受体蛋白激酶OsRPK1。OsRPK1蛋白利用SMART软件分析其保守结构域,该蛋白含有一个跨膜域,N端存在信号肽,胞外区具有6个亮氨酸拉链富集区(LRR); C端含有蛋白激酶保守结构域。OsRPK1和水稻OsRLK1、OsLRK1、OsBRI1、OsXa21、拟南芥AtRPK1、玉米ZmRLK和胡萝卜DcPSKR等植物中的LRR型受体蛋白激酶序列同源性分别25.31%、22.7%、21.3%、23.07%、22.68%、20.47%和25.05%。构建系统进化树分析表明OsRPK1和玉米中ZmRLK同源关系较近。 为了进一步研究该激酶的生理功能,利用DNAStar Protean软件对水稻受体激酶OsRPK1勺抗原指数分布进行了分析,选择抗原性和特异性均较高的Aa 154-350片段作为抗原,通过反转录PCR得到cDNA片段,并亚克隆至pET29a原核表达载体,在大肠杆菌BL21中实现了高表达,表达量约为细胞总蛋白的30%。重组蛋白经SDS-PAGE分离,染色切胶收集后,作为抗原免疫新西兰家兔,分离抗血清,经纯化和Western blot检测,得到1:20000效价的多克隆抗体。该抗体能特异识别在原核表达系统内表达的抗原,以及水稻根尖细胞质膜组分中的LRR型受体蛋白激酶。利用该制备抗体通过免疫电镜直接验证了OsRPK1的亚细胞定位是细胞质膜。通过western blot研究了盐、干旱、冷和ABA等非生物胁迫条件下OsRPK1的表达情况,发现盐胁迫12h OsRPK1的表达显著上调,至胁迫48h表达仍维持在较高的水平,OsRPK1免疫组化分析进一步证实了上述结果;干旱胁迫3h和12h OsRPK1的表达显著上调,48h后又恢复到正常水平;OsRPK1对冷不敏感,胁迫48h表达量只有轻微增加;ABA处理下,OsRPK1表达持续上升。研究结果表明,OsRPK1表达主要由渗透胁迫引起,因为在植物中盐胁迫和干旱胁迫比冷胁迫能更直接引起渗透胁迫;由于这三种胁迫都和ABA相关,所以外源ABA处理能快速引起OsRPK1表达。……   
[关键词]:水稻;质膜;蛋白质组;转录组;LRR型受体蛋白激酶;非生物胁迫
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:南京农业大学2008年