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苏云金芽孢杆菌CryIAc重组蛋白及土曲霉PNR2发酵产物的杀虫活性研究

李翔

  本研究在一株苏云金芽孢杆菌HD-73中,通过PCR-RFLP方法确定其中含有cryⅠAc基因。根据GenBank中cryⅠAc类基因序列设计引物对ORF-1、ORF-2及COM-1、COM-2,经PCR扩增分别得到cryⅠAc基因的ORF和全长(包含启动子、ORF和终止子)。序列测定结果表明,该基因全长4202 bp, ORF长3537 bp,编码1178个氨基酸,利用Antheprot软件分析,预测其蛋白分子量为133.35 kDa,等电点pI=4.825。经Blast序列比对结果表明,ORF的核酸序列与数个已公布的cryⅠAc类基因同源达99%,编码氨基酸序列的同源性达99.7%。 将cryⅠAc基因的ORF克隆至pMD19-T载体上,用Bam HI和SalⅠ进行双酶切,和经相同酶切的pET-30a(+)载体连接,得到重组表达质粒pETcO.将pETcO转化E. coli BL21 (DE3),利用IPTG进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE检测,发现转化菌株ETcO能正确表达CrylAc蛋白,分子量为130 kDa左右。 将苏云金芽孢杆菌HD-73于NB液体培养基中进行种子培养后,在1/2 NB液体培养基中发酵72 h,利用等电沉淀法提取了CrylAc原毒素。经SDS-PAGE检测,原毒素蛋白的分子量与上述重组蛋白一致。 利用浸叶法,将CryⅠAc重组蛋白对斜纹夜蛾和小菜蛾进行了生物测定,结果对二者均显示了高杀虫活性,LCso分别为2.334μg/ml和4.444μg/ml。 Dihydrocitrinone和细胞松弛素N是从本实验室一株土曲霉PNR2经固态发酵后,分离纯化得到的两种次生代谢产物。利用浸叶法将两种化合物对斜纹夜蛾、小菜蛾和烟粉虱进行了生物测定。结果表明,dihydrocitrinone在浓度为200μg/ml时的校正死亡率仅为5.7%(斜纹夜蛾)、3.2%(小菜蛾)、7.4%(烟粉虱);细胞松弛素N在浓度为200μg/ml时对烟粉虱的校正死亡率为12.5%,对两种鳞翅目昆虫有相对较高的毒力,LCso分别为856.556μg/ml(斜纹夜蛾)和98.026μg/ml(小菜蛾)。……   
[关键词]:苏云金芽孢杆菌;CryIAc重组蛋白;土曲霉;固态发酵产物;杀虫活性生物测定
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:南京农业大学2010年