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α-半乳糖苷酶高产菌株的筛选及其基因的克隆、表达、纯化和性质研究

贲培培

  α-半乳糖苷酶(a-galactosidase,a-D-galactoside galactohydrolase;EC 3.2.1.22)也称蜜二糖酶,属于外切糖苷酶类。可以特异性催化移除不同底物中α-末端连接的非还原性D-半乳糖。α-半乳糖苷酶广泛存在于动物、植物、微生物中。而微生物种类繁多、分布广泛、适应性强,因此是α-半乳糖苷酶的主要来源。该酶在食品、饲料、医药工业等领域得到广泛的应用,受到业内的高度重视,被认为是最有应用潜力的酶制剂之一。 本实验从236个土样中筛选到一株α-半乳糖苷酶高产菌株,经16s rDNA鉴定及生理生化鉴定为巨大芽孢杆菌,命名为巨大芽孢杆菌MEPE0049。以棉籽糖为底物测定比酶活为1.22 U/mg。对该菌株的产酶条件,包括装液量,接种量,碳源,氮源,最适温度,最适pH和金属离子对其产酶的影响进行了研究,以找到最适产酶条件,更好的使其产酶。 此外,我们还研究了巨大芽孢杆菌MEPE0049粗酶液的最适反应温度、温度稳定性,最适反应pH值、pH值稳定性及金属离子Cu2+,Fe3+,Ca2+,Ni+, Zn2+, Mg2+,Mn2+,Co2+对其酶液反应的影响。结果表明来源于该菌株的α-半乳糖苷酶粗酶液在45℃高温时丧失其活性,且在pH小于5的条件下酶活稳定性较差。大多数金属离子对其活性没有很大影响,只有Co+使酶活性降到30%以下。 将Cazy数据库中已登录的α-半乳糖苷酶的序列与巨大芽孢杆菌的总基因组进行比对,得到两个序列。设计四条特异性引物,通过PCR扩增得到大小为1323 bp的agaA基因和大小为2226 bp的agaB基因。将该两段基因连接到pET-29a上,在E.coil BL21中进行表达。重组子pET-29a-agaA粗酶液没测到酶活,而重组子pET-29a-agaB粗酶液比酶活达到9.86 U/mg,将重组子pET-29a-agaB粗酶液进行Ni-NAT柱纯化,纯化后比酶活达到380.66 U/mg。将该酶纯化后,研究其酶学性质,发现和粗酶的酶学性质并无明显区别。……   
[关键词]:巨大芽孢杆菌;α-半乳糖苷酶;性质研究;基因克隆;重组表达;纯化
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:南京农业大学2011年