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红花黄素腹腔注射联合MSCs移植对脊髓损伤大鼠运动功能的影响及机制研究

卜志勇

  目的:脊髓损伤(Spinal Cord Injury, SCI)的治疗仍然是一个世界性的难题。本实验中应用红花黄素腹腔注射联合骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, MSCs)移植治疗大鼠模型SCI,探讨红花黄素腹腔注射和MSCs移植对脊髓损伤大鼠运动功能的影响及作用机制,为提高SCI临床治疗效果寻找新的治疗措施。 方法:贴壁培养分离法分离、纯化大鼠MSCs;75只S-D大鼠随机分为5组,每组15只:A组(红花黄素+MSCs组),B组(生理盐水+MSCs组),C组(红花黄素+PBS组),D组(生理盐水+PBS组)为对照组;E组(补充组)。改良Allen法制作脊髓损伤模型。造模成功后,A组和B组立即在损伤局部注射器注入60ul的浓度为1×105/μl的MSCs,C组和D组注入等体积的无菌PBS液;造模术后第1d起,A组和C组的动物给予腹腔注射红花黄素治疗(40mg/kg,1次/日),直至动物被处死取材或治疗达14d;B组和D组中动物同法注射等体积的生理盐水。实验过程中,A、B、C、D组中若有动物死亡则从E组中随机选取补充,以保证A、B、C、D组中实验动物数目相同。于造模术后1d、2d、3d、4d、7d取各组损伤处脊髓检测SOD、MDA和细胞凋亡,术后1d和7d、14d、21d、28d采用改良BBB评分法对各组动物进行行为学检查评分,同时取损伤处脊髓冰冻切片,HE染色显微镜下观察组织结构变化。 结果: 1.采用改良的Allen法制作SCI模型:打击时应用导引筒导引重锤,使打击更精准;通过控制重锤的质量和自由下落的高度能精确控制打击量;在打击部位加垫片,使打击部位受力更均匀;打击后立即移开重锤,防止了持续压迫性损伤;通过操作技术培训和预实验,保证了操作的熟练程度,最终使得每只大鼠脊髓损伤部位和损伤程度基本一致,具有可比性。造模后硬脊膜保持完整,但损伤脊髓组织在损伤后立即出现出血、水肿,渐出现组织坏死,随后部分修复,最后见特征性的空腔形成、实质细胞萎缩、胶质瘢痕形成,病理学表现与人类脊髓损伤有较好的一致性。 2.造模前所有S-D大鼠BBB评分均为21分。造模后所有大鼠双后肢、尾部迟缓性瘫痪,大小便失禁,尿潴留,只能以前肢拖着后半躯体匍匐前行。造模成功后24h时所有大鼠BBB评分均为0分。造模后7d内所有大鼠后肢运动功能均无明显恢复,各组间差异性无统计学意义(P>0.05)。7d后各组大鼠的后肢运动功能逐渐出现不同程度的恢复,以A组的恢复速度最快,D组最差。造模后第14d、21d、28d时BBB评分,A组、B组和C组明显高于D组,且有A组高于B组和C组,差异有统计学意义(P<0.05)。B组和C组间差异不大。 3.损伤脊髓组织切片HE染色显示:(1)造模成功后1d时,损伤区域灰质和白质界限不清,中心区域的细胞结构丧失,细胞形态无法辨认,周围区域的神经细胞明显肿胀、变性,大量的炎性细胞浸润和红细胞弥散,部分融合成片状,有的区域形成空腔;各组之间差异不大;(2)7d后损伤修复情况好与坏与BBB评分得分的高与低相一致,而且在A组和B组中可以见到细胞形态不同于神经细胞和胶质细胞的大体积细胞(考虑为移植的MSCs),其数量与BBB评分得分高低呈同向变化,A组中大体积细胞数目多于B组,C组和D组未见类似细胞;各组空腔的数目和面积大小与BBB评分得分高低呈反向变化,A组在相同时间点空腔最少,D组最多,B组和C组的情况居中。 4.脊髓损伤后,损伤脊髓组织内SOD活性显著降低,MDA明显升高,在各时间点A组、B组和C组SOD活性均高于D组(对照组)((P<0.05),且A组明显高于B组和C组(P<0.05);在造模成功后3d、4d和7d时,A组、B组和C组MDA含量均低于D组(P<0.05),且A组MDA含量在造模成功后2d、3d和4d时低于B组和C组(p<0.05);在各相同时间点,A组、B组和C组的细胞凋亡数均少于D组(对照组)(p<0.05),A组凋亡的细胞数还显著少于B组和C组(p<0.05)。 结论: 1.改良Allen法制作大鼠SCI模型,操作简单,重复性好,损伤脊髓的病理变化与人类SCI相似,满足实验研究的要求; 2.红花黄素腹腔注射能够减少脊髓损伤局部自由基生成和减轻脂质过氧化,抑制损伤脊髓组织内神经细胞的凋亡,从而减轻继发性损伤,促进SCI后运动功能的恢复; 3. MSCs移植能够减少脊髓损伤局部自由基生成和减轻脂质过氧化,抑制损伤脊髓组织内神经细胞的凋亡,从而减轻继发性损伤,促进SCI后运动功能的恢复; 4.红花黄素腹腔注射联合MSCs移植对大鼠SCI模型的治疗具有协同效应,在减少脊髓损伤局部自由基生成和减轻脂质过氧化、抑制损伤脊髓组织内神经细胞的凋亡、促进SCI后运动功能的恢复方面,优于单纯的红花黄素腹腔注射和单纯的MSCs移植组。……   
[关键词]:脊髓损伤(SCI);红花黄素;骨髓间充质干细胞(MSCs);细胞凋亡;动物实验
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:湖北中医药大学2011年