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特发性卵巢早衰与TGFBR3基因多态性的相关性研究

覃春容

  卵巢早衰(premature ovarian failure, POF)是一种由于各种因素引起的卵巢功能提前衰退的疾病,由于其病因复杂性,且大部分病例无病因可寻,称为特发性卵巢早衰,给治疗带来了相当的困难。该病目前有发病年轻化、发病率升高的趋势,卵巢早衰是病程较长的一种疾病,且病程中受到多因素的影响,存在个体差异性。在不同年龄阶段、不同社会文化背景的卵巢早衰病人当中,临床表现可能各有侧重。在第一部分中,我们探讨卵巢早衰的临床特点,为进一步病因研究提供线索。 在卵巢组织上抑制素(inhibin, INH)通过辅助受体TGFBR3在调控卵泡生长发育、调节颗粒细胞增生分化、反馈调节垂体促性腺激素的合成分泌、影响卵泡选择、排卵等方面发挥调节卵泡发育、成熟、闭锁的作用,TGFBR3基因突变可能改变其mRNA的表达、结构及其与配体的亲和力,影响与INH的结合,并可能失去INH介导的FSH降调作用,因此TGFBR3被推测作为卵巢早衰的一个候选基因。在第二部分中,我们用直接测序对110例中国特发性POF患者进行TGFBR3基因多态研究。 虽然直接测序敏感度最高且是突变检测的金标准,但不适合大规模高通量的突变筛查。近年来发展起来的一项新的突变检测技术,变性高效液相色谱(denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC)技术是一项高通量、经济、敏感、特异的筛查技术,为解决这一问题提供了可能。我们在第三部分初步建立DHPLC技术用以筛查特发性卵巢早衰TGFBR3基因多态性,评价其敏感性和临床应用价值,为DHPLC分析的后续临床应用提供理论和方法学依据。用测序与DHPLC两种方法对标本进行检测以进一步确认TGFBR3基因多态与中国特发性POF的关系。 第一部分特发性卵巢早衰的临床研究 目的:探讨特发性卵巢早衰(POF)的临床特点,为进一步病因研究提供线索。 方法:回顾性分析2009年2月-2010年9月在南方医院生殖中心、南方医院附属深圳市妇幼保健院妇产科诊治的110例中国汉族特发性卵巢早衰患者的临床资料,对月经特点、发病情况、B超结果和妊娠情况等进行研究。 结果: 1、特发性POF患者的临床特征 5例患者为原发性闭经,105例均为继发闭经,闭经年龄14.5-39岁(28.25±6.97岁),2例(1.8%)在月经初潮后有1-2次月经即出现闭经,闭经前月经规律而突然闭经患者13例(11.8%),92例(83.6%)患者早期表现月经稀发,月经稀少渐至闭经,110例染色体核型分析为46,XX,其中28例具有多态性。特发性卵巢早衰患者年龄、13MI、初潮年龄、文化程度、职业差异、与对照组差别无统计学意义。因此两组人群具有较好的可比性。 2、特发性POF患者的发病情况 30岁以前发病的POF患者占55.2%,83.8%患者最长停经1年以内。81.9%患者病程5年以内。58.2%的患者月经周期改变前无明显事件,37.3%患者月经周期改变继发于某些事件之后,如妊娠相关事件(5.5%),生活环境或方式变化(9.1%),工作压力(8.2%),接触有害物质(9.1%),服用事后避孕药(3.6%)。 3、特发性POF患者的的超声下卵巢形态 特发性POF患者的子宫体积、卵巢体积小于正常组,基础窦卵泡计数(AFC)明显少于对照组,79例患者B超可探及双侧卵巢(71.8%),5例患者B超可探及单侧卵巢(4.5%),26例患者B超双侧卵巢显示不清(23.6%)。卵巢体积≥2cm3的POF患者有28例(25.5%),<2cm3的POF患者有82例(74.5%),正常卵巢大小的(卵巢体积≥2cm3)患者中有19例有窦卵泡(67.9%),而小卵巢(卵巢体积<2cm3)的患者中有32例有窦卵泡(39%),差异有统计学意义(P=0.008)。34例在确诊POF后定期监测有间断恢复排卵和月经的现象,用阴道B超定期监测有2例患者恢复排卵后自然妊娠,妊娠率1.8%。 结论: 对月经不规律、稀发患者,应用B超监测子宫体积,卵巢体积和AFC,同时进行激素测定,及早判断是否是POF的高危人群,尽量避免其接受外界环境的不良刺激。 第二部分TGFBR3基因多态与特发性卵巢早衰的相关性研究 目的:探讨TGFBR3基因多态与特发性卵巢早衰的相关性,寻找POF的致病基因。以期为POF的预防和治疗提供理论基础。 方法:收集110例特发性POF患者及110例月经规则,性激素检查在正常范围内,B超卵巢形态正常的年龄匹配的对照组的外周血样标本,利用盐析法提取外周血白细胞中的DNA,设计TGFBR3基因16个外显子编码区及其侧翼的引物,通过对PCR反应产物直接测序后进行序列分析。 运用生物软件Polyphen、SIFT、PMUT、PROSITE和Clustal W2程序对TGFBR3基因发生的错义突变进行保守性分析和预测对蛋白质功能造成的影响,探讨TGFBR3基因突变致POF的分子生物学机制。 结果: 1、TGFBR3基因序列分析结果 总共检测了TGFBR3基因16个外显子序列的15个DNA片断,在其中的11个片断中,共发现了28个SNP(single nueleotide polimorphism, SNP),均为二等位基因型。其中转换23个(12个A/G,11个C/T),颠换3个(2个A/C,1个T/A),双碱基缺失1个,四碱基插入1个。12个为新发现,16个为NCBI的SNP数据库中已报道的。12种新发现SNP:包括外显子的3种错义突变:c.1370A>G (p. E459G), c.2467C>T (p. P825L)和c.2502G>A (p. I837V),外显子的2种同义突变:c.516C>T (p.S172S)和c.660T>C (p.C220C),内含子的转换:c.382-110A>G,c.566-122A>G和c.734+11C>T。内含子的颠换:c.59-32T>A, c.381+12A>C, c.2431-7A>C。内含子的缺失:c.1408-37_1408-38delGG。 2、TGFBR3基因外显子新发现错义突变分析 在TGFBR3基因外显子新发现3个错义变异;c.1370A>G (p. E459G), c.2467C>T (p. P825L)和c.2502G>A (p. I837V)。c.1370A>G (p. E459G)和c.24670C>T (p. P825L)只在POF组出现,在正常对照组中未发现突变。c.2502 A>G(p.1837V)在POF组和对照组均有发现,与对照组相比,1837V GA基因型的频率比较高[χ2=6.0517, P=0.014, odds ratio (OR)=2.322,95% confidence interval (CI):1.169-4.613],因此,c.2502G>A(p.1837V)是新发现的错义SNP, c.1370A>G (p. E459G)和c.2467C>T(p.P825L)是新发现错义突变。 (1)用Clustal W2软件对氨基酸进化保守性分析,结果示TGFBR3基因编码第459位谷氨酸和第825位脯氨酸在生物进化过程中均处于高度保守。 (2)我们利用Polyphen、SIFT和IPMUT3种程序预测点突变对蛋白质功能造成的影响。p.E459G, Polyphen预测为possibly damaging,但SIFT预测为Tolerated,2种预测结果不同,因此我们应用PMUT程序,PMUT预测为Pathological,可靠性指数为1,结果示TGFBR3基因E459G可能对TGFBR3蛋白质功能造成影响。p.P825L, Polyphen预测为Damaging, SIFT预测为Intolerated, PMUT预测为Pathological,可靠性指数为8,这些预测一致性地提示TGFBR3基因P825L是影响蛋白质功能的突变。 (3)用PROSITE scanning在TGFBR3基因P825L未发现有结构和功能区域,但在TGFBR3基因E459G发现有一个TGFBR3蛋白的zona pellucida (ZP) domain。 (4)TGFBR3跨膜结构预测 向数据库SOSUI(http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/)提交TGFBR3氨基酸序列进行蛋白二级结构预测,发现E459G位于胞外区,P825L发生在胞内区。 3、TGFBR3基因型在特发性POF患者和对照组中的分布 (1)、对18个常见SNP(其中2个为新发现SNP)进行统计学分析,发现c.566-71C>T、c.2022T>C、c.2502A>G和c.2568G>A的等位基因频率以及基因型频率在患者和对照组有显著性差异(P<0.05),c.566-216G>A的基因型频率在患者和正常对照之间有显著差异。其余多态位点在两组中的基因型分布相似。 (2)、采用二分类Logistic回归计算TGFBR3基因这5个SNP致POF的发病危险性,结果显示,c.566-216G>A、c.566-71C>T和c.2502A>G在病例和对照组之间有显著性差异。 4、TGFBR3基因单倍型在特发性POF患者和对照组中的分布 POF组GCCGA, GCTAG和ATTGA单倍型发生频率显著高于对照组,而GTTGG单倍型则相反。 5、TGFBR3基因型的人群分布研究 中国汉族人群TGFBR3基因566-216G>A和2022T>C位点的基因型分布与印度人群存在显著差异(P=0.000和P=0.004)。 结论: 1、E459G和P825L,是国内外尚未报道的新发现的TGFBR3基因突变,这也是首次在中国人身上发现TGFBR3基因突变。用Polyphen、SIFT、PMUT、PROSITE和Clustal W2程序预测,结果示E459G和P825L可能是影响蛋白质功能的突变。 2、c.566-216G>A、c.566-71C>T和c.2502A>G基因型分布显著改变,提示其在特发性卵巢早衰的基因学、病因方面起着重要的作用。 3、单倍型分析提示GCCGA, GCTAG和ATTGA与特发性卵巢早衰有关。 4、TGFBR3基因566-216G>A和2022T>C结合位点多态分布可能在不同人群之间存在显著差异,提示不同人群存在遗传异质性。 5、TGFBR3基因的变异可能是中国特发性卵巢早衰的病因,亟待进一步研究。 第三部分DHPLC筛查特发性卵巢早衰TGFBR3基因多态方法的建立及临床应用研究 目的:初步建立变性高效液相色谱(DHPLC)技术用以筛查特发性卵巢早衰TGFBR3基因多态,评价其敏感性和临床应用价值,为DHPLC分析的后续临床应用提供理论和方法学依据。用两种方法对标本进行检测以进一步确认TGFBR3基因多态与中国特发性POF的关系。 方法:用DHPLC筛查特发性卵巢早衰TGFBR3基因多态,以第二部分DNA测序结果为“金标准”,确定出针对TGFBR3基因16个外显子扩增的10个片段的最佳检测条件,计算DHPLC法的灵敏度、特异度、假阴性率、假阳性率、约登指数、似然比、阳性预测值和阴性预测值等指标;同时随机抽取20%的样本,以相同的实验条件,重新进行DHPLC分析,与第一次DHPLC分析的结果进行比较,计算Kappa指数值,最后综合所有的指标评价DHPLC检测TGFBR3基因突变的敏感性和临床应用价值。 结果:DHPLC分析的条件可PCR引物的设计、PCR方法及条件、分离温度及分离梯度等方面进行适当优化,所得出的阳性和阴性样本的色谱图区分非常明确、直观。通过测序方法检测出的多态,用DHPLC同样可以检出,灵敏度达到100%;特异性可达到98.4%,约登指数为98.4%,假阳性率为1.6%,假阴性率为0,阳性似然比为62.5,阴性似然比为0,阳性预测值99.0%,阴性预测值100%,前后两次DHPLC分析的Kappa指数值为0.888(P<0.05),表明DHPLC分析具有较高的真实性、可靠性和实用性。 结论: (1)建立了应用DHPLC检测TGFBR3基因突变的技术平台,首次在国内应用DHPLC技术对TGFBR3进行突变检测。 (2)DHPLC检测TGFBR3基因突变,在不降低传统的TGFBR3测序检测方法灵敏度的前提下,实现了检测的快速、经济与高效,并具有较高的真实性、可靠性和实用性,有望成为今后TGFBR3基因检测的重要技术。 (3)用测序与DHPLC两种方法进行检测,均提示TGFBR3基因的变异可能是中国特发性卵巢早衰的病因,亟待进一步研究。……   
[关键词]:卵巢早衰;特发性;TGFBR3;基因多态;变性高效液相色谱(DHPLC)
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:南方医科大学2011年