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大黄鱼刺激隐核虫病病原生物学特性的研究

周旻曦

  近几年在我国东海养殖大黄鱼中出现一种危害严重的流行性疾病,主要症状为,病鱼体表、鳍条及鳃瓣布满大小白色点状虫体和包囊,肉眼可见,称“白点病”,其病原为刺激隐核虫(Cryptocaryonirritans)。该寄生虫会引起鱼的活动异常、上皮增生、呼吸困难以及机械损伤,继而带来病菌的继发感染。然而,国内对于刺激隐核虫的病原生物学研究及该病检测技术方面的研究比较少,目前仍无有效防治大黄鱼刺激隐核虫病的技术方法。本文深入研究了大黄鱼刺激隐核虫病的病原生物学特性,以及快速检测方法,为刺激隐核虫病的防控技术研究及实行刺激隐核虫病原的监测、检测等提供了实验依据和理论基础。 大黄鱼刺激隐核虫病病原分离及传代:从患刺激隐核虫病的大黄鱼体表成功分离获得病原生物,并建立了一套以大黄鱼为寄主的刺激隐核虫传代系统。该系统循环周期短、方法简单易行、虫体收集产量较高,为后续刺激隐核虫生物学特性的研究给予实验材料的保障。 温度、盐度对刺激隐核虫包囊孵化率的影响:培养温度为17℃~27℃时刺激隐核虫包囊的孵化率随温度的上升而逐渐增高,27℃时达到最大值为95%。当温度升至32℃时孵化率下降到65%,37℃时孵化率仅为15%。适宜刺激隐核虫包囊孵化的盐度范围较宽,在15‰~35‰的海水盐度下,孵化率均可达到95%以上,最适盐度为20‰~25‰。刺激隐核虫包囊和幼虫发育过程中显微及亚显微观察:包囊在发育初期 0~24h时,表面光滑,囊壁较薄,外壁平整,常附着一些棒状细菌,内层为数层致密层(厚约1.7μm)。发育中期(24h~48h),包囊表面出现粗糙结构,囊壁厚度可达5μm以上,分层明显,此阶段食物泡、脂肪体和高尔基体等散布在包囊的整个细胞质中,且线粒体,高尔基体和粗面内质网明显增多。发育后期(48h~72h),隐约可见包囊内发育的幼体呈椭圆形或球形。此时囊壁继续增厚,厚度达10μm以上,但分层变得不明显,包囊壁的外壁呈粘滞且柔软。幼虫脱包后0~8h,虫体全身遍布体纤毛且较为浓密,细胞结构比较完整,活动能力强;脱包后8h~16h的刺激隐核虫幼虫,其体纤毛数量明显减少,纤毛脱落露出体部毛基体;脱包后16h~24h时,幼虫细胞体纤毛和口纤毛几乎完全脱落,细胞大小严重萎缩,已基本丧失活动能力。 浸泡药物对离体刺激隐核虫包囊和幼虫的影响:高锰酸钾浓度为9mg/L浸泡12min幼虫开始死亡,24min可有效杀死全部幼虫,浓度低于9mg/L对幼虫无杀灭效果。双氧水浓度为120μl/L有较好的杀灭效果,58min可全部杀死。硫酸铜在1mg/L~25mg/L的浓度内,对幼虫无杀灭效果,但硫酸铜浓度为20mg/L以上能完全抑制包囊发育。低盐度水对幼虫的杀灭效果随着盐度不断降低,杀灭效果越好,6.0‰的海水15min即可完全杀死幼虫,但其对包囊的杀灭效果不如幼虫明显。福尔马林在70μl/L的浓度下32min幼虫全部死亡,而其浓度在100μl/L以上对包囊有50%以上的杀灭效果。 根据刺激隐核虫18S-ITS2序列,设计两对特异性引物,经反应条件优化,建立了刺激隐核虫的LAMP检测方法。该方法对刺激隐核虫检测的灵敏度为10-7ng/μlDNA,具有很高的特异性,通过对病鱼组织和水样的检测分析,显示良好的应用前景。……   
[关键词]:大黄鱼;刺激隐核虫;生物学特性;超微结构;分子检测
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:宁波大学2012年