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复合功能型酸敏纳米药物运载体系的制备及性质研究

李飞

  在肿瘤化疗中,发展和完善安全高效的药物转运系统和技术是促进药物临床应用的关键。现阶段的抗肿瘤药物通常有极高的生物毒性且缺少特异选择性,在杀伤肿瘤细胞的同时,也会影响到正常组织细胞。作为理想的药物转运系统,它必须具有较长的体内循环时间和适宜的稳定性,能够保护药物在正常组织的转运过程中不提前渗漏或失活;能够靶向特异的病灶部位并在外部刺激的作用下释放药物。为了实现这一想法,许多药物转运系统被赋予了一定的功能特性,如pH敏感脂质体、胶束、引入靶向基团的聚合物纳米粒及聚合物前药等。其中,pH响应的多功能聚合物纳米粒备受关注。肿瘤细胞由于糖的无氧酵解旺盛产生大量乳酸,使其细胞内pH值低于正常细胞,相差约0.7pH。肿瘤细胞外pH在6.5-7.2之间,细胞内的内涵体和溶酶体则酸性更强,分别在5.0-6.5之间和4.5-5.0之间。正常组织的pH为一个恒定值7.4。这种pH的显著性差异可作为实体瘤治疗的突破口。因此,结合纳米载体本身具有的被动靶向特性及表面修饰靶向分子后具有的主动靶向特性,pH响应型释药的靶向纳米药物载体可以更进一步提高载体对肿瘤部位的选择性、提高药物对病灶部位的治疗效率,减少药物的毒副作用。 本论文是在pH响应型的功能性抗肿瘤纳米药物载体的大背景下展开的。课题研究分别从酸敏载体和酸敏化学键入手,构建了三种不同类型的pH响应型纳米药物载体。第一部分的研究工作是从酸敏载体的角度出发,系统的对比了三种磺胺二甲氧嘧啶衍生物与葡聚糖反应后形成的纳米载体的理化性质,筛选得到一组具有pH敏感特性的纳米体系。研究中对三种纳米体系各自的自组装成粒机理过程进行了探讨。第二部分研究工作则从酸敏化学键的角度出发,将聚合物药物进一步制备成纳米粒的形式,并同时包封其他疏水性的药物,共同发挥作用。但是研究中我们发现,该纳米载体不可避免的会感应肿瘤细胞外pH释药。且胞外释放的药物有可能重新扩散分布到正常组织,降低药物的靶向特异性。因此,在前面这两部分工作的基础上,第三部分的研究工作中我们采用酸敏载体和酸敏化学键相结合的策略,针对肿瘤耐药细胞,构建了一组新型复合功能的pH响应型药物载体,并以一种新颖且简单的方法引入并保护穿膜肽。与文献报道的繁琐的屏蔽-去屏蔽保护方法相比,更具有可行性。分别考察了纳米药物载体的形态、粒径、表面电荷,临界胶束浓度等理化性质及酸敏特性,并进行了初步的体外抗肿瘤活性研究。具体内容如下: 第一部分马来酰化葡聚糖/磺胺二甲氧嘧啶(Dex-MA/SD)纳米载体的制备及其性质研究 以葡聚糖和酸敏材料磺胺二甲氧嘧啶为主要原料,首先合成出三种葡聚糖/磺胺二甲氧嘧啶的系列衍生聚合物:马来酰化葡聚糖/磺胺二甲氧嘧啶(Dex-MA/SD),马来酰化葡聚糖/聚磺胺二甲氧嘧啶(Dex-MA/PSD)和葡聚糖/羧基化磺胺二甲氧嘧啶(Dex/COOH-OSDM)。通过调节亲水链段和疏水链段的比例,筛选出当Dex-MA/SD体系中Dex-MA:SD为1:3(w/w),Dex-MA/PSD体系中Dex-MA:PSD为2:3(w/w),Dex/COOH-OSDM体系中Dex:COOH-OSDM为4:3(w/w)时,由透射电镜观察制备的纳米粒粒径均匀(100nm左右),分散性较好。实验中系统对比了SD、PSD及COOH-OSDM与改性葡聚糖或葡聚糖反应后形成的三种纳米体系的理化性质,并选择在pH7.4的去离子水中透析成纳米粒,形成了一种与之前文献报道的不同的纳米粒结构。芘荧光法测定的Dex-MA/SD,Dex-MA/PSD和Dex/COOH-OSDM的临界聚集浓度分别是3.0μg/mL,4.9μg/mL,5.2μg/mL。临界聚集浓度越小,表明该体系就越稳定。自组装成粒后,三者的zeta电位分别是-47.1mV,-28.3mV,-8.18mV。在随后的粒径和zeta电位随pH变化的研究中,只有Dex-MA/SD纳米体系表现出了pH敏感性,另两组则没有。由此,根据三种纳米体系的结构特点对三种纳米体系成粒机理进行了探讨。结果表明:Dex-MA/SD纳米体系因其表面带有部分的SD基团具有更灵敏的酸敏特性,优于后两组。pH7.4时,Dex-MA/SD粒径为92nm。pH6.8时,其粒径迅速增大到222nm。体外模拟释药性质的研究中,选用阿霉素为药物模型。Dex-MA/SD纳米粒在pH7.4,pH7.0,pH6.8,pH6.0的介质中释药2h后,其药物累积释放率分别是6.0%,13.2%,20.0%,24.0%。随着pH的依次减小,相同时间内药物累积释放率依次增大。pH6.0时,20h内药物累积释药率接近75%。在体外肿瘤细胞内摄作用的研究中,pH6.0,pH6.8时,细胞内阿霉素的荧光强度明显高于pH7.4时的荧光强度。表明在Dex-MA/SD纳米粒的作用下,pH6.0,pH6.8时阿霉素进入细胞的量要多于pH7.4的情况,这也是和体外模拟释药实验的结果相吻合的。这些结果表明Dex-MA/SD纳米载体具有显著的pH敏感释药特性,可有望成为一种pH响应释药的抗肿瘤药物载体。 第二部分共转运阿霉素(Dox)和吡咯烷硫氨甲酸铵(PDTC)的叶酸-普鲁兰多糖-阿霉素(FA-MP-Dox)聚合物纳米载体的制备及其性质研究 克服肿瘤多药耐药是癌症化疗中的一个瓶颈问题,如何克服外排蛋白作用,提高药物在肿瘤细胞内的浓度成为解决肿瘤耐药性的关键问题。经特异性配体修饰的纳米粒具有主动寻靶的特性,可以在一定程度上缓解肿瘤细胞耐药性的影响。此外,当NF-κB抑制剂与化疗药物联合应用时,NF-κB抑制剂可增强放化疗的治疗效果,亦能达到降低耐药性的效果。但是现阶段的药物输送体系亟需解决的问题是载药能力太低。如在纳米颗粒载体或脂质体内,载药量一般不超过10%。因此在本部分实验中,利用酸敏连接臂酰胺键将药物阿霉素键合到叶酸-普鲁兰多糖的聚合物链上,将FA-MP-Dox聚合物药物进一步制备得到聚合物纳米粒,并同时包封抗肿瘤药物Dox和目前最有效的NF-κB活性抑制剂PDTC,得到FA-MP-Dox/PDTC+Dox纳米体系。通过化学键合和包封相结合的方法提高体系的载药率。其中FA-MP-Dox聚合物中阿霉素和叶酸的含量为7.5wt%,2.0wt%。纳米粒粒径在152nm左右,形态圆整。两种药物的释放呈现出较强的pH依赖性。30h后,pH5.0和pH7.4时,阿霉素的药物累积释药率分别达到53%和26%。这是由于在pH5.0时部分酰胺键发生酸解断键,FA-MP-Dox体系中键合的阿霉素逐渐被释放出来,造成纳米粒结构逐步解离。在此时的酸性环境中,游离的阿霉素带有正电荷,药物分子间产生静电斥力,从而加速释放出包封的药物。以阿霉素敏感的A2780细胞和耐药的A2780/DOXR为体外肿瘤细胞模型,分别研究了不同纳米体系的细胞毒性和内摄作用。对于耐药A2780/DOX~R,FA-MP-Dox/PDTC+Dox纳米粒的细胞毒性(IC50为9.8μM)比MP-Dox/PDTC+Dox(IC50为20μM)的细胞毒性显著增强。阿霉素由于细胞耐药性的存在,细胞毒性相对较弱。因此受体介导的纳米粒一定程度上缓解了肿瘤细胞的耐药性的影响。此外,对于A2780细胞来说,FA-MP-Dox/PDTC+Dox纳米粒的细胞毒性(IC50=2.0μM)同样高于MP-Dox/PDTC+Dox (IC50=7.5μM)。但是此时FA-MP-Dox/PDTC+Dox纳米粒却没有阿霉素(IC50=0.17μM)的细胞毒性强。在内摄作用研究中,对于A2780/Dox~R来说,FA-MP-Dox/PDTC+Dox纳米粒的入胞程度远高于MP-Dox/PDTC+Dox纳米粒或游离Dox,且主要分布在细胞核和细胞质中。没有包封PDTC的FA-MP-Dox/Dox纳米粒中释放的阿霉素在细胞膜周围分布的较少,从而证实除叶酸分子的靶向作用外,FA-MP-Dox/PDTC+Dox纳米体系在PDTC的协同作用下,进一步提高了阿霉素在肿瘤细胞内的浓度,在一定程度上克服了肿瘤细胞的耐药性。 第三部分包载Dox-TAT的促黄体生成素释放激素-聚乙二醇-聚组氨酸-阿霉素(LHRH-PEG-PHIS-Dox)纳米载体的制备及其性质研究 研究中我们发现,即使采用共转运耐药逆转剂和化疗药物的方法来对抗多药耐药性,纳米载体仍不可避免的在胞外释药,降低药物的靶向特异性。因此,生物活性分子的细胞内转运仍是药物转运的一个关键问题。穿膜肽(如TAT)具有细胞膜亲和性高、穿膜速度快、降解迅速等优势,可直接带领大分子或药物穿过细胞膜,尤其是对于耐药细胞同样有效。基于这一点,本实验中选用更为适合的酸敏材料,采用酸敏载体和酸敏化学键相结合的策略,制备了LHRH-PEG-PHIS-Dox/Dox-TAT载药胶束。芘荧光法测定LHRH-PEG-PHIS-Dox的临界胶束浓度为4.9μg/mL,表明该体系具有较好的稳定性。当pH从8.0减小到5.0的时候,粒径从78nm迅速增大到158nm,粒径随pH的减小而增大。在体外模拟释药性质的研究中,20h后,在pH6.8的释放介质中,LHRH-PEG-PHIS-Dox/Dox-TAT的累积释药率为67%,而在pH7.4的环境下,药物累积释放率还不到19%。这是因为在pH<7.0时,胶束溶胀,粒径变大,利于药物的渗透释放,另外此时胶束自身带有了部分正电,与正电性的Dox-TAT间产生静电斥力,从而也可加速药物的释放。粒径、zeta电位和体外模拟释药实验结果证实LHRH-PEG-PHIS-Dox/Dox-TAT具有灵敏的pH响应特性。在细胞毒性的研究中,包封Dox-TAT的LHRH-PEG-PHIS-Dox纳米体系在pH6.8时的细胞毒性强于包封Dox的LHRH-PEG-PHIS-Dox和LHRH-PEG-PHIS-Dox纳米体系。流式细胞仪分析和内摄作用研究的结果亦表明:pH6.8时,包封Dox-TAT的LHRH-PEG-PHIS-Dox纳米体系入胞后的荧光强度相对最高,且在细胞核和细胞质中均有分布。这说明释放的Dox-TAT在TAT的作用下,可避开耐药性的影响,快速进入细胞。综上所述,在这个体系中,阿霉素以酸敏连接臂酰胺键键合到PHIS的链端,既增强了胶束的稳定性,同时又提高了载药率。并且利用聚组氨酸不同pH时的溶解性差异,有效控制Dox-TAT药物的释放,以一种新颖且简单易行的方法保护了TAT。LHRH-PEG-PHIS-Dox/Dox-TAT综合了超酸敏材料聚组氨酸和穿膜肽TAT的优良特性,可有望成为一种兼有主动靶向、高效入胞和酸敏释药特性的多功能靶向释药体系。……   
[关键词]:多功能药物载体;pH;敏感;多糖;聚组氨酸;转录激活蛋白
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:第四军医大学2012年