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牦牛MSTN和IGF-IR基因的克隆及SNPs与生长性状相关性研究

梁春年

  本研究以4个地方牦牛品种(甘肃天祝白牦牛、甘肃甘南牦牛、青海高原牦牛、新疆巴州牦牛)和1个培育品种(青海大通牦牛)为研究对象,利用分子生物学技术,克隆牦牛MSTN、IGF-IR基因并进行序列测定,借助生物信息学分析软件,对牦牛MSTN、IGF-IR基因序列与其他物种序列进行比对;推测编码蛋白质的二、三级结构和一些理化性质;对五个牦牛品种的MSTN、IGF-IR基因进行PCR-SSCP多态性分析,同时对检测到的多态性与牦牛生长发育性状进行相关分析,筛选牦牛生长发育的遗传标记,为开展牦牛分子育种研究奠定理论基础。研究结果表明: 1.设计特定引物对牦牛MSTN基因分段PCR扩增并进行克隆和测序,利用分子生物学软件序列拼接,获得牦牛MSTN基因序列,序列全长6613bp(GenBank登录号EU926670),将获得的牦牛MSTN基因序列与其他物种相应序列比对表明,牦牛MSTN基因由3个外显子和2个内含子组成,CDS序列全长为1128 bp(GenBank登录号EU926669),编码375个氨基酸。3个外显子大小分别为373 bp、374 bp和381 bp,2个内含子大小分别为1843 bp和2028 bp。 2.牦牛与普通牛的MSTN基因编码区中,在417位发生一次碱基转换(C→T),但未造成氨基酸改变。牦牛与普通牛、绵羊、猪、小鼠、人、狗、马、兔子、鸡、猩猩各物种间核苷酸相似性大小分别为99.9 %、96.5 %、94.3 %、89.1 %、91.9 %、91.3 %、93.6 %、91.7 %、82.0 %、92.0 %。牦牛与普通牛MSTN氨基酸序列相似性最高,为100 %;而与绵羊、猪、小鼠、人、狗、马、兔子、鸡、猩猩各物种间相似性大小分别为93.3 %、95.5 %、92.5 %、94.1 %、93.3 %、94.9 %、94.4 %,88.0 %、94.4 %。 3.生物信息学分析表明,牦牛MSTN基因编码蛋白的理论分子量约为42.6 kD,PI值为6.14。该蛋白最常见的二级结构以α-螺旋、β-折叠、随机卷曲为主,其第三外显子编码的蛋白α-螺旋很少。牦牛MSTN基因编码蛋白属于跨膜蛋白,跨膜区位于AA6-AA23之间;具有一个分泌信号肽结构,其氨基酸序列MQKLQICV YIYLFMLIVA具有TGF-β家族的特征。三级结构同源建模预测结果显示,牦牛MSTN基因成熟区段氨基酸序列与卵泡抑素288复合物有98.17%的相似性,说明牦牛MSTN基因和其他哺乳动物的卵泡抑素288复合物关系密切,并同属于TGF-β家族。 4.设计特定引物对牦牛IGF-IR基因分段RT-PCR扩增并进行克隆和测序,获得牦牛IGF-IR mRNA序列,序列全长4350bp,包括牦牛该基因的全部外显子和部分5′-侧翼区、3′-侧翼区序列。该序列编码1367个氨基酸。 5.牦牛与普通牛的IGF-IR基因编码区中,发现有20处碱基改变,其中发生C到T碱基转换7次,发生G到A碱基转换2次,发生T到C碱基转换6次,发生A到G碱基转换3次,发生G到T碱基颠换2次。将由编码区推导出来的牦牛IGF-IR蛋白与普通牛该蛋白序列进行比对,发现位于IGF-IR基因编码区的9个碱基变异造成3个氨基酸改变:6 G→R、29T→I、30 S→I的改变。牦牛与普通牛、猪、人、狗、小鼠、猩猩、鸡等物种IGF-IR氨基酸序列间相似性分别为99.9%、98.3%、97.6%、92.5%、95.0%、97.0%、82.3%。 6.生物信息学分析发现,牦牛IGF-IR基因编码的蛋白质理论分子量为154949.3,理论PI值为5.71。牦牛IGF-IR基因编码的蛋白质二级结构有α-螺旋、β-折叠、β-转角及随机卷曲等。推测该蛋白质存在3个跨膜结构,跨膜区位于AA6-AA26,AA938-AA958和AA1188-AA1209之间。且该蛋白具有信号肽序列,最可能的剪切位点位于30-31位氨基酸之间。用同源建模的方法得到其成熟区段氨基酸序列与人的IGF-IR基因有98.68%的相似性。 7.采用PCR-SSCP技术对牦牛MSTN基因多态性检测,分析了多态性与牦牛生长性状的相关性。结果表明,检测到2个多态位点,分别在外显子1和内含子2上。在外显子1扩增片段的第176bp处有一个A转换G的单碱基突变,在内含子2扩增片段的第192bp处有一个A转换G的单碱基突变。牦牛MSTN基因内含子2存在2个等位基因和3种基因型。在该基因座上,甘南牦牛、天祝白牦牛、青海高原牦牛三个群体处于Hardy-Weinberg平衡状态,大通牦牛、新疆巴州牦牛两个群体处于不平衡状态。三种基因型与牦牛部分生长性状的最小二乘法分析表明,MSTN基因内含子2存在的多态位点对周岁牦牛体斜长和体重等均有显著影响(P<0.05);不同基因型对周岁牦牛体高、胸围、管围等的影响均不显著(P>0.05)。MSTN基因内含子2的存在的多态位点对成年牦牛胸围、体重均有显著影响(P<0.05);不同基因型对成年牦牛体高、管围、体斜长等的影响均不显著(P>0.05)。 8.采用PCR-SSCP技术对牦牛IGF-IR基因多态性检测,分析了多态性与牦牛生长性状的相关性。结果表明,检测到1个多态位点,在外显子1扩增片段的第242bp处有一个C转换A的单碱基突变。该位点在各牦牛群体中均存在多态性,有三种基因型,由一对等位基因控制。在该基因座上,大通牦牛、甘南牦牛、天祝白牦牛、青海高原牦牛四个群体处于Hardy-Weinberg平衡状态,而新疆巴州牦牛群体在该位点处于不平衡状态。三种基因型与牦牛部分生长性状的最小二乘法分析表明,IGF-IR基因外显子1存在的多态位点对周岁牦牛体高、体斜长、体重等均有显著影响(P<0.05);不同基因型对周岁牦牛胸围、管围等的影响均不显著(P>0.05)。IGF-IR基因外显子1不同基因型对成年牦牛体高、胸围、管围、体斜长、体重等的影响均不显著(P>0.05)。……   
[关键词]:牦牛;MSTN基因;IGF-IR基因;克隆;序列分析;SNP检测;相关性分析
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:甘肃农业大学2011年