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中国美利奴和哈萨克绵羊MHC-DRB1外显子2多态性与包虫病抗性研究

李仁燕

  包虫病又称细粒棘球蚴病,是一种呈世界性流行的人兽共患寄生虫病,家畜感染包虫病后,出现食欲减退,畜体消瘦,严重地影响家畜的生产性能。在我国,该病已被列为重点防治的寄生虫病之一。几年来经多方面的努力,包虫病的发病率虽然有所降低,但始终没有得到很好的控制。主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)作为研究疾病抗性与易感性的候选基因,已经成为分子免疫遗传育种的研究热点。本研究采用PCR-RFLP方法检测中国美利奴(新疆军垦型)、哈萨克绵羊MHC-DRBl外显子2的多态性,分析了该基因多态性与包虫病抗性及易感性之间的关系。筛选出了哈萨克绵羊MHC-DRB1外显子2抗包虫病的基因单倍型MvaⅠbc-SacⅡab-Hin1Ⅰab,并通过人工感染攻虫试验对该单倍型进行了验证,从而为培育抗包虫病绵羊新品系奠定基础。具体试验内容及结果如下: 1.利用绵羊包虫病ELISA试剂盒对中国美利奴羊(新疆军垦型)进行检测,选取其中的包虫病阴性羊604只,阳性羊425只。以PCR-RFLP方法,对MHC-DRB1基因外显子2的遗传多态性进行了检测。经五种内切酶SacⅡ、MvaⅠ、SacⅠ、Hin1Ⅰ和HaeⅢ酶切后出现了14种等位基因,31种基因型。将包虫病阳性羊与阴性羊的基因型频率进行比较分析发现,中国美利奴羊(新疆军垦型)的HaeⅢab、HaeⅢce、HaeⅢde、HaeⅢee(P<0.01)基因型与包虫病的抗性相关,而SacⅡaa(P<0.05)和HaeⅢbd、Hin1Ⅰbb、HaeⅢcf、HaeⅢef (P<0.01)基因型与包虫病的易感性相关。 2.利用绵羊包虫病ELISA试剂盒检测哈萨克绵羊,对302只包虫病阳性羊,400只阴性羊,采用PCR-RFLP方法分析哈萨克绵羊MHC-DRB1基因外显子2的遗传多态性。经五种内切酶SacⅡ、MvaⅠ、SacⅠ、Hin1Ⅰ和HaeⅢ酶切后出现了14种等位基因,28种基因型。将包虫病阳性羊和阴性羊的基因型频率比较分析,发现基因型MvaⅠbc、Hin1Ⅰab、SacⅡab、HaeⅢde、HaeⅢdf和HaeⅢdd(P<0.01)与包虫病的抗性相关,基因型MvaⅠbb、SacⅡaa、Hin1Ⅰbb、HaeⅢef(P<0.01)和HaeⅢab(P<0.05)与包虫病的易感性相关。 将两个品种与包虫病的抗性及易感性基因型进行品种间比较分析,结果显示,基因型SacⅡaa、Hin1Ⅰbb与HaeIIIef在两个绵羊品种中对包虫病均表现出高度的易感性(P<0.01),而基因型HaeIIIde则表现出较强的抗性(P<0.01);对同一基因型在两个绵羊品种的包虫病阴性和阳性羊中进行多重比较分析发现,基因型MvaⅠbc在两个绵羊品种中差异显著(P<0.05);对两个绵羊品种的抗包虫病基因型进行单倍型分析,仅筛选出了哈萨克绵羊抗包虫病基因单倍型MvaⅠbc-SacⅡab-Hn1Ⅰab,对该单倍型的基因序列进行比对发现,各酶切位点的突变均属于有义的突变。 3.选取经包虫病ELISA试剂盒检测阴性,具有单倍型MvaⅠbc-SacⅡab-Hin1Ⅰab的8只健康两周岁哈萨克绵羊作为试验组,另外选取与包虫病抗性或易感性无关,且单倍型为SacⅡab-Hin1Ⅰab, MvaⅠbc-Hin1Ⅰab, MvaⅠbc-SacⅡab的8只两周岁健康哈萨克绵羊作为对照组,进行人工攻虫。在攻虫后第0d,7d,14d,30d,45d,60d,75d,90d,105d,120d集血液,共计10次血样用于攻虫后试验组和对照组绵羊部分血液指标的分析。攻虫四个月后,屠宰结果显示,试验组中有2只绵羊感染包虫病,对照组中有7只感染包虫病,试验组包虫病感染率显著低于对照组(P<0.05),说明单倍型MvaⅠbc-SacⅡab-Hin1Ⅰab确实对包虫病具有一定的抗性。 另外,利用全自动血细胞分析仪测定攻虫后10个不同时间点采集血液的白细胞、粒细胞、淋巴细胞的数量及淋巴细胞所占比率。结果显示,试验组白细胞与淋巴细胞的数量显著高于对照组(P<0.05),说明包虫病感染初期,试验组较强的抗性,不利于包囊的形成。 4.采集攻虫后10个不同时间点的血液,利用荧光实时定量PCR,并结合ELISA法检测了试验组与对照组血液及血清中IL-2, IFN-y, TNF-a, IL-4和IL-10的表达水平。结果显示IL-2与TNF-a在试验组中的表达量始终高于对照组,且在攻虫后45d,血清IL-2在试验组中显著高于对照组(P<0.05),而血液中IL-2 mRNA的表达在试验组与对照组中差异不显著。攻虫后90d与105d,试验组血清中TNF-a含量显著高于对照组(P<0.05),血液TNF-a mRNA的表达在攻虫后90d试验组显著高于对照组。IL-4与IL-10在攻虫后120d,对照组mRNA的表达水平显著高于试验组(P<0.05)。以上结果表明,试验组感染包虫病后以Thl细胞占优势,诱导机体产生保护性免疫,而对照组感染包虫病后则以Th2细胞占优势,使机体对包虫病的易感性增强。 5.收集攻虫后10个不同时间点的血清,测定IgE, IgG, IgM与谷丙转氨酶及总蛋白的含量。结果显示,IgE, IgG, IgM在试验组中的含量高于对照组,但无显著差异,说明绵羊抵抗包虫病的侵袭不是以体液免疫为主。另外攻虫后30d,对照组中谷丙转氨酶含量显著高于试验组(P<0.05),说明试验组能够抑制包虫对肝脏的损伤。试验组中的血清总蛋白总体上高于对照组,试验组血液中高水平的蛋白可能更有利于修复肝脏的损伤,从而表现出较强的抗性。 综上所述,中国美利奴羊(新疆军垦型)、哈萨克绵羊MHC-DRB1基因外显子2的多态性与包虫病抗性或易感性相关。经研究证实,具有抗包虫病MHC-DRB1基因单倍型MvaⅠbc-SacⅡab-Hin1Ⅰab的哈萨克绵羊感染包虫病后,机体通过诱导Thl细胞产生保护性免疫,同时也表明哈萨克绵羊MHC-DRB1外显子2抗包虫病基因单倍型MvaⅠbc-SacⅡab-Hin1Ⅰab能够作为包虫病抗性相关的分子标记,进行哈萨克绵羊抗包虫病的选育。……   
[关键词]:中国美利奴羊(新疆军垦型);哈萨克绵羊;MHC-DRB1外显子2;包虫病;PCR-RFLP
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:石河子大学2011年