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泰勒虫新型诊断方法的建立和未定种生物学特性研究

王利霞

  牛泰勒虫病是由寄生于牛红细胞内的蜱传性血液原虫泰勒虫所引起,它广泛分布于世界各地,严重影响着畜牧业生产,造成巨大经济损失,在兽医界广被重视。目前国内外报道的牛泰勒虫有多种,部分泰勒虫种在分类学上尚存在争议,尤其瑟氏泰勒虫(Theileria sergenti)、水牛泰勒虫(Theileria buffeli)和东方泰勒虫(Theileria orientalis)三个种因各国学者常根据其分离到的地理位置或宿主进行命名,因此其分类学地位争议很大。随着生物学技术的迅速发展,至今已经建立了一系列用于泰勒虫病诊断的技术,然而不同诊断方法各有其利弊,依然需要更敏感、快速、简单的诊断方法用于该病的诊断。 本研究建立了多种泰勒虫诊断方法并应用建立的方法对我国的泰勒虫病进行了流行病学调查。同时本研究对分离于我国不同地区的泰勒虫18S rRNA基因和ITS (ITS1-5.8S rRNA-ITS2)基因进行了克隆和测序分析,通过系统发育树分析发现了一株水牛源泰勒虫未定种,可能为一个新种,随后对该虫株进行了实验动物感染试验和传播媒介蜱确定试验。主要研究结果如下: 1.泰勒虫血清学调查 本研究采用以瑟氏泰勒虫p23蛋白为抗原建立的间接ELISA诊断方法对采集于我国不同地区的水牛和黄牛血清样品以及南非的水牛血清样品进行了泰勒虫病血清学调查,结果显示我国泰勒虫阳性率为46.9%(107/228),南非的泰勒虫阳性率为51.3%(118/230),南非的泰勒虫阳性率略高于我国,但是在统计学上没有显著差异。同时利用该方法对两头PCR检测为瑟氏泰勒虫阳性的黄牛的抗体水平进行了长约两年的监测,结果显示其抗体一直维持在较高水平。上述研究结果为我国泰勒虫病防控措施的制订提供了基本依据。 2.梨形虫LAMP方法的建立 以梨形虫18S rRNA基因序列为靶基因设计一组引物,建立了用于检测梨形虫的LAMP诊断方法。确定该LAMP的敏感度为0.000008%,特异性结果显示该方法可以扩增瑟氏泰勒虫、牛泰勒虫未定种、环形泰勒虫、东方巴贝斯虫、牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫,不能扩增牛温扬氏附红细胞体、牛边缘无浆体、刚地弓形虫,说明该方法特异性扩增梨形虫,适合用于我国梨形虫病流行情况调查和流行特征监测。 3.瑟氏泰勒虫LAMP和PCR方法的建立和应用 我国流行的泰勒虫主要是瑟氏泰勒虫,因此本研究依据瑟氏泰勒虫p33基因序列设计引物分别建立了用于瑟氏泰勒虫检测的LAMP和PCR方法。LAMP和PCR均特异性的扩增瑟氏泰勒虫,敏感度为分别为0.000002%和0.00002%。应用这两种诊断方法对采集于我国各地的313份样品血样进行了检测并对两种方法进行了比较,检测结果显示该PCR方法的检出率略低于LAMP方法,但两种方法的检出率在统计学上没有显著差异。 4.泰勒虫遗传进化分析 对不同地区梨形虫的ITS基因全长和18S rRNA基因全长进行了PCR扩增、克隆和测序,通过建立系统发育树分析发现我国主要存在六种梨形虫:瑟氏/水牛/东方泰勒虫、环形泰勒虫、中华泰勒虫、水牛源泰勒虫未定种、东方巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫。分析发现不同梨形虫的ITS基因拥有特定的长度:瑟氏/水牛/东方泰勒虫和中华泰勒虫ITS基因长1200bp或2400bp;环形泰勒虫ITS基因长1000bp;水牛源泰勒虫未定种ITS基因长1500bp;东方巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫ITS基因长900bp,说明可以通过ITS基因长度并结合分离宿主来判断虫种类别。 5.水牛源泰勒虫未定种诊断和生物学特性研究 根据水牛源泰勒虫未定种ITS基因序列设计一对特异性引物,建立了用于检测水牛源泰勒虫未定种PCR方法并进行了应用。对该泰勒虫新种进行了动物感染试验和蜱传播试验。结果显示黄牛接种该虫种后一直未感染,水牛接种前期检测到感染,水牛的血液学指标检测结果显示该虫的感染可引起血液学指标的变化。蜱传播试验结果显示亚东璃眼蜱幼蜱到若蜱,若蜱到成蜱阶段均不能传播该虫种;镰形扇头蜱幼蜱到若蜱不能传播该虫种。 本研究建立的诊断方法为监控我国梨形虫流行情况和发病特征提供了有力工具;对梨形虫的遗传进化分析为梨形虫的分类学研究提供了科学依据;对泰勒虫新种的生物学特性研究对丰富我国寄生虫研究资源具有重要意义。……   
[关键词]:泰勒虫病;水牛源泰勒虫未定种;诊断方法;分类学研究
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:华中农业大学2011年