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疯草产苦马豆素内生真菌筛选及其发酵产物抑菌活性试验

卢围

  植物内生真菌是指在其生活史中某一段时期内或整个生命时期内,生活于植物组织内部,而对宿主不引起明显疾病症状的一类真菌。研究发现,内生真菌的次生代谢产物中含有很多具有生物活性的物质。 疯草是棘豆属(Oxytropis)和黄芪属(Astragalas)两属有毒植物,动物采食后能够引起以神经机能紊乱为特征的中毒。苦马豆素(Swainsonine,SW)为疯草主要毒素,一种吲哚里西啶生物碱(indolizidine alkaloids),由于分离于苦马豆而得名。苦马豆素药用前景非常广阔,在很多药用领域潜力巨大,尤其是其抗肿瘤活性引起了国内外学者的广泛关注。通过对疯草内生真菌的分离、鉴定以及发酵产物检测等研究发现,疯草中存在产苦马豆素内生真菌,如埃里格孢菌(Embellisia sp.)等。 本研究针对疯草灾害较为严重的内蒙古、青海和宁夏地区,采集小花棘豆、黄花棘豆、甘肃棘豆和变异黄芪。然后进行内生真菌分离、纯化、鉴定和菌种保藏。对内生真菌发酵产物进行成分分析,以期鉴定出产苦马豆素内生真菌,并以分离得到的内生真菌为发酵菌种,检测其发酵液和菌丝体不同极性段的抑菌活性,为我国疯草内生真菌的开发利用奠定基础。本研究取得如下成果: 1.疯草产苦马豆素内生真菌筛选按照不同植物部位进行内生真菌分离、纯化和菌种保藏。采用薄层色谱法(TLC)和气相色谱法(GC)对内生真菌发酵产物进行成分分析,薄层色谱法和气相色谱法的定性和定量检测结果显示有两株内生真菌的次生代谢产物中含有苦马豆素:XJ-H-1菌株发酵液中SW含量为16.7338 mg/L,XJ-J-1菌株发酵液中SW含量为4.2092 mg/L。 2.产苦马豆素菌株的鉴定结合菌落、菌丝以及孢子的形态学观察和真菌5.8SrDNA-ITS序列测定分析,对两株产苦马豆素内生真菌进行鉴定。两株产苦马豆素内生真菌在形态学上存在微小差异,但在5.8SrDNA-ITS序列水平上完全相同,同源性高达100%。XJ-J-1和XJ-H-1与层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)比对同源性高达99%。通过系统发育树分析,这两株产苦马豆素内生真菌与层出镰刀菌的亲缘关系较近,自检支持率高达90%。结合《真菌鉴定手册》的形态学描述,提示XJ-H-1(XJ-J-1)为层出镰刀菌。 3.内生真菌发酵产物抑菌活性研究通过对上步试验分离鉴定出的产苦马豆素内生真菌—层出镰刀菌生物发酵,依次采用石油醚、氯仿,乙酸乙酯和正丁醇(体积比1:1)萃取内生真菌的发酵产物,制备药敏片。经KB,MIC和MBC试验测定其发酵液和菌丝体不同极性段的抑菌活性。结果显示:层出镰刀菌发酵液的乙酸乙酯极性段具有良好的抑菌活性,对枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠埃希菌的抑菌圈直径分别为1.660 cm,1.984 cm,1.902 cm,1.902 cm。对其MIC分别为0.39 mg/mL,3.125 mg/mL,1.56 mg/mL,0.78 mg/mL。对其MBC分别为3.125 mg/mL,12.5 mg/mL,6.25 mg/mL,6.25 mg/mL。……   
[关键词]:疯草;内生真菌;分离鉴定;苦马豆素;抑菌活性
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:西北农林科技大学2011年