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芽孢杆菌新型蛋白酶基因的克隆、表达及理化性质研究

刘海军

  本课题组对一株从土壤分离纯化的高产蛋白酶芽孢杆菌BLYS-1进行了深入研究,该菌所产蛋白酶对大豆蛋白具有较强的水解和脱苦作用,应用潜力较大。本研究采用同源序列法克隆了该蛋白酶基因,并在大肠杆菌BL21中进行了表达;同时对该菌的产酶条件进行了优化,采用优化的条件培养该菌后提取纯化蛋白酶,对酶的理化特性进行了研究;最后采用该菌发酵水解大豆蛋白,获得到大豆肽,并用该大豆肽喂养小鼠,考查了大豆肽对小鼠的主要生理指标的影响,研究结果如下: 1.蛋白酶基因克隆及表达 根据GenBank中的蛋白酶基因同源序列设计PCR引物,从芽孢杆菌BLYS-1中克隆了一个新蛋白酶基因NP。该基因与NCBI基因库中登录的枯草芽孢杆菌所产的胞外金属蛋白酶基因(GenBank:L10505.1)同源性达99.39%。以pET28a为出发质粒,构建含有NP蛋白酶基因的表达载体pET28aNP,将该表达质粒导入大肠杆菌BL21中。经50μmol/mlIPTG诱导培养,SDS-PAGE检测,结果显示NP基因在BL21中能够表达分子量大小约为30kDa的蛋白,并在干酪素培养基上培养后产生水解圈,表明该蛋白酶基因的表达产物具有水解蛋白的活性。 2.芽孢杆菌发酵产酶条件优化 本文对草芽孢杆菌BLYS-1产酶工艺进行了初步研究。探讨了以及碳源、糖源和无机盐等培养基的组成以及pH、温度、转速、装液量和接种量等操作条件对蛋白酶表达的影响。培养基组分优化结果显示1.0%淀粉以及1.5%玉米粉对该菌的发酵酶活影响较大。芽孢杆菌发酵条件的单因素实验表明初始pH9、装液量100ml/250ml、温度35℃、接种量8%、转速150r/min等单因子条件有利于蛋白酶产量的提高。最佳的操作条件组合为T(35℃)pH(9)装液量(100ml)接种量(8%),通过正交优化可以使发酵酶活达700U/ml。利用响应面法优化发酵产酶工艺,模拟出发酵的最高酶活力为800.650U/ml。 3.蛋白酶理化性质分析 提取芽孢杆菌BLYS-1蛋白酶,探讨pH值、温度、有机溶剂、金属离子、氧化剂和EDTA等对其影响。研究发现,该芽孢杆菌蛋白酶具有一定酸碱耐受性,在pH5-8时活性较高,其最适pH值约为7,最佳反应温度为40-60℃,70%饱和度的硫酸铵基本可以使其完全沉淀,并表现一定的抗氧化性。有机溶剂吐温和异丙醇、变性剂SDS、金属离子SnP~(2+)P、CaP~(2+)P、NiP+P对蛋白酶抑制作用较大,MgP~(2+)P、ZnP~(2+)P等对该酶有促进作用。以干酪素为底物,测得该酶动力学参数Km值为2.53g/L,Vmax值为6.67μg/s。 4.大豆肽对小鼠生理的影响 将48只健康的昆明系小老鼠分为六组,分别利用纯净水、大豆多肽液、大豆蛋白酶解液、豆浆液、大豆蛋白液及BLYS-1的大豆蛋白发酵液对其连续灌胃30天,研究每组小鼠的抗疲劳能力及其脾脏、肾脏、肝脏功能及血液特征。研究表明芽孢杆菌BLYS-1发酵型大豆肽等有利于小鼠增重,延长小鼠爬杆和游泳时间,并能提高脾脏指数和肾脏指数,增加肝脏糖原储备能力;与纯净水组相比,各种灌胃试剂在一定程度上有利于血液中乳酸脱氢酶含量的升高,而发酵型大豆肽可以使血液中血尿氮含量降低。……   
[关键词]:芽孢杆菌;基因克隆;蛋白酶;发酵条件优化;理化性质;生理功能
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:三峡大学2011年