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HRE启动子调控分泌表达PR39重组AAV的构建及在CHD基因治疗中的应用研究

聂小维

  目的 为了探讨HRE启动子控制下分泌表达PR39重组AAV对缺血性心脏病基因治疗,本实验首先人工合成微小HRE,构建T-HRE-CMV-PolyA载体,再将NT4-TAT-His-PR39装入HRE调节的腺相关病毒载体,验证其在人脐静脉内皮细胞(CRL-1730细胞株)表达、及其在猪AMI后对心肌细胞促血管生成作用。 方法 1﹑设计微小HRE/CMV,应用PCR技术人工合成和T载体克隆法克隆,酶切鉴定后进行DNA测序及分析。2﹑将编码HRE/CMV、NT4-6His-PR39的基因片段用T4DNA连接酶连接,构建成质粒pSS-HRE-CMVNT4-6His-PR39-PolyA-AAV。3﹑采用磷酸钙沉淀法三质粒共转染HEK-293细胞,包装成重组病毒,并应用斑点杂交试验测定其滴度。4﹑等体积pSS-HRE-CMV- NT4-6His-PR39-PolyA-AAV和空病毒(EV)分别感染人脐静脉内皮细胞(CRL-1730细胞株),免疫细胞化学测定6×His在CRL-1730内表达情况,验证PR39的表达情况。5﹑18只小型猪建立AMI模型后随机分为实验组1(HRE-AAV-PR39组)、对照组1(生理盐水组)、对照组2(空病毒组),应用MR电影技术和心肌灌注MR成像,来评估缺血区的范围。定期处死猪后,获取缺血区心肌标本,收集形态学、病理学数据。 结果 1﹑根据文献和数据库资料,设计迄今最小HRE序列,经PCR技术成功合成,并插入到pGEM-Teasy质粒中进行克隆,送DNA测序检测,其结果与设计的序列一致。 2﹑单酶切法获得大量的HRE,再连入改造后的pSSHGAAV(pSSV9int-/Xba I)载体,再经EcoR I和BamH I双酶切后插入已合成的NT4-6His-PR39基因片段,两次反应均经酶切鉴定正确,说明重组质粒pSS-HRE-CMV- NT4-6His-PR39-PolyA-AAV构建成功。 3﹑采用磷酸钙沉淀法三质粒共转染包装细胞,并应用斑点杂交试验测定其滴度大小为3.4×10~9 p.f.u。 4﹑免疫细胞化学测定CRL-1730中HRE调控下NT4-TAT-His-PR39中的6×His表达,实验组阳性表达有统计学意义。 5﹑心肌MR灌注成像显示梗死心肌面积在pSS-HRE-CMV-NT4-PR39-PolyA-AAV作用下明显减小,有统计学意义。结论 1﹑使用PCR方法可以将人工合成的HER插入缺乏内切酶识别点的CMV启动子上游,并制备低氧调控的真核表达载体。 2﹑成功构建pSS-HRE-CMV-NT4-TAT-6His-PR39-PolyA-AAV,并包装成较高浓度的病毒。 3﹑免疫细胞化学测定CRL-1730中人工合成的微小HRE能够有效的调控CMV启动子控制的下游基因NT4-TAT-His-PR39表达。 4﹑MR电影技术和心肌灌注MR成像可有效定量评价AMI的范围和心肌血流灌注。 5﹑重组pSS-HRE-CMV-NT4-PR39-PolyA-AAV可以促进心肌缺血区新血管生成,有效减小心肌梗死区面积,改善心功能。……   
[关键词]:低氧反应元件HRE;低氧诱导;基因治疗;心肌梗死
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:第四军医大学2011年
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