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分泌广谱抗菌肽乳酸菌的筛选及高效表达的调控研究

易华西

  食品防腐剂对提高食品保藏性和延长食品保质期具有重要作用。现在使用的防腐剂仍以化学防腐剂为主,存在食品安全隐患。Nisin是世界公认安全的天然食品防腐剂;但Nisin抗菌谱较窄,只能抑制革兰氏阳性菌,对革兰氏阴性细菌、酵母菌、霉菌及病毒无抑制作用。以Pediocin为代表的ClassⅡa类细菌素具有抑菌谱广、稳定性高、分散性好、安全高效等优点倍受关注,但生物合成量低是其产业化瓶颈。本研究从我国传统发酵食品中筛选到一株对典型革兰氏阳性和革兰氏阴性食品腐败菌均具有抑制作用的Lactobacillus paracasei -J23,经研究确定发挥抗菌作用的为肽类物质Bac-J23,进一步研究了Bac-J23的分离纯化、理化特性及生物学信息、合成条件优化以及活性修饰与应用影响因素。 根据ClassⅡa抗菌肽N-端保守氨基酸序列(-YGNGV-)这一特征,建立了基于Colony-PCR法的产ClassⅡa抗菌肽乳酸菌高通量筛选方法;利用此方法从分离于我国传统发酵食品的275株乳酸菌中筛选得到抑菌活力和抗菌谱均有明显优势的ClassⅡa抗菌肽产生菌株1株,经Biolog鉴定系统和16SrDNA从代谢水平和分子水平上鉴定为Lactobacillus paracasei,并确定了抗菌物质为多肽类物质Bac- J23。联合菌体细胞吸附-解吸法、阳离子交换法和疏水层析法对Bac- J23进行了分离纯化,纯化倍数和回收率分别为45.1和16.4%。Bac-J23纯化样品在Tricine-SDS-PAGE电泳上呈单一条带,分子量近似为6.56KD,HPLC色谱呈单一峰。Bac- J23的N-端部分氨基酸序列研究表明,Bac- J23的N-端序列为:(K, N, D)-Y-G-N-V-G(V)-V- (A, F)-(V, F),具有明显的ClassⅡa抗菌肽特征。Bac-J23的理化性质研究及相关生物学特性预测结果表明, Bac-J23疏水性氨 基酸含量丰富,含有一种未知氨基酸。Bac-J23理论等电点为9.145,实测等电点为8.9,280nm消光系数为ε=27850L/mol/cm。DSC分析Bac-J23冻干样品的变性温度为86.35℃,焓变为16.49J/g。Bac-J23在酸性环境下稳定,对蛋白酶K、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶敏感,不能被胃蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶水解。Bac-J23巯基和二硫键含量分别为10.18 mol/106g和21.15 mol/106g。亚细胞定位和跨膜区预测表明Bac-J23为分泌型多肽,为非膜蛋白,无跨膜区存在。同源性分析表明,相似度较高的为来源于Lactobacillales、Enterococcaceae、Enterococcus产生的一种暂命名为Enterocin E-760的抗菌肽。Bac-J23的发酵合成条件研究表明,Lactobacillus paracasei -J23生产Bac-J23体 现出温度、pH梯度和接种剂量依赖性,响应面优化结果表明最适温度和pH分别为36.8℃和5.2,接种量阈值为2.13×10~4CFU/ml。最适培养基组分为蔗糖(20g/L)、酵母提取物(0.5%)、牛肉膏(1%)、KH_2PO_4(20g/L)、柠檬酸氢二铵(0.2%)、MgSO_4(0.2g/L)、MnSO_4(0.25g/L)。在优化条件下,Bac-J23合成量提高1.68倍,达到5400 U/ml。基于群体感应系统对Bac-J23的合成调控研究表明,Bac-J23的合成受其自身诱导调控,具有诱导作用的Bac-J23阈值为2.5×10~(-10)M,当添加量超过6.4×10~(-8)M,Bac-J23合成达到饱和量3200U/ml;Bac-J23的诱导作用表现出时效性,仅在Lactobacillus paracasei -J23对数生长末期之前添加表现出诱导效应。利用静息细胞技术筛选Bac-J23的合成诱导物研究表明,甘油、半胱氨酸、甘氨酸、丙酮酸对Bac-J23合成具有诱导作用,最高可使Bac-J23活力提高4倍,而谷氨酸、酪氨酸,丙氨酸等均未检测到诱导作用。Lactobacillus paracasei -J23与大肠杆菌和枯草芽孢杆菌共培养有利于Bac-J23的生物合成,但两种指示菌分泌的Bac-J23合成诱导物分别存在于发酵上清液和菌体细胞内部,且与两种菌的接种量有关。大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的接种量阈值分别为1.8×10~4CFU/ml和5.2×10~4CFU/ml,可使Bac-J23合成量提高2-6倍。 Bac-J23有限水解修饰研究结果表明,经蛋白酶K与胰蛋白酶酶解后均出现两种主要产物,分子量分别为4.5KD、1.9KD、3.8KD和2.5KD。Bac-J23酶解后丧失了与敏感菌细胞结合能力和体内抗菌活性,但是体外抗菌活力增强,体外抗菌物质主要是Bac-K2和Bac-T2。食品成分和相关环境对Bac-J23的活性影响研究表明,酪蛋白和卵磷脂对Bac-J23抗菌活力具有负面影响,当卵磷脂浓度大于0.8%,Bac-J23对指示菌基本完全失去抗菌活性。EDTA和NaCl与Bac-J23共存时表现出联合抗菌效应,但当食品环境中NaCl浓度大于6%,则完全抑制了Bac-J23的合成。Bac-J23常温保存一年仍保留了接近50%的活性,表明Bac-J23贮存稳定性较好。……   
[关键词]:乳酸菌;抗菌肽;筛选;纯化;合成调控
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:哈尔滨工业大学2010年