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氧自由基对大鼠小肠上皮细胞的损伤及硫辛酸的干预研究

王啸春

  目的:本试验通过体外培养大鼠小肠上皮细胞(IEC),建立黄嘌呤氧化酶/黄嘌呤(XO/X)和过氧化氢(H2O2)对IEC氧化损伤模型,研究不同氧自由基对小肠上皮细胞损伤与功能的关系,以及硫辛酸(LA)对XO/X与H2O2氧化胁迫下IEC的干预作 用。方法:实验一:对原代培养大鼠IEC的分离方法做出改进与简化:联合运用300 U/mL胶原酶Ⅺ和100 mg/ml中性蛋白酶I分离新生大鼠小肠,可得到完整隐窝单位和少数单个小肠上皮细胞,在5%FBS-DMEM/F12生长培养基中,3-4d形成细胞集落,7-8d细胞汇合需要传代,用0.05% Trypsin-EDTA消化细胞,传代后细胞增殖能力较强,运用刮除法和相差消化相差贴壁法进行纯化,经免疫组化法鉴定能够得到纯度80%以上的小肠上皮细胞,为研究营养素对肠上皮细胞的作用提供了理想的体外模型。 实验二:XO/X与H2O2损伤IEC模型的建立:以不同浓度的XO/X( 5、10、50、100、200U/L XO和10μmol/L X)和不同浓度的H2O2 (0.1μmol/L、1μmol/L、2.5μmol/L、10μmol/L、30μmol/L、100μmol/L和1mmol/LH2O2),分别作用IEC细胞3、12、24、48h,以四唑盐(MTT)比色法检测细胞活力氧化,确定XO/X和H2O2损伤模型适宜损伤浓度和损伤时间。 实验三:XO/X和H2O2氧化胁迫模型下大鼠IEC损伤与修复及LA的干预作用:XO/X模型下,空白对照组:细胞正常培养24h; XO/X损伤组:细胞中加入50U/L XO,10μmol/L X后,培养24 h; XO/X+LA药物组:细胞与不同浓度的LA(0.lμg/ml、1μg/ml和10μg/ml)预孵3 h,再加入50U/L XO培养24h。H2O2模型下:空白对照组:细胞正常培养24h; H2O2损伤组:加入100μmol/L H2O2后,培养24 h; H2O2+LA药物组:细胞与不同浓度的LA(0.lμg/ml、1μg/ml和10μg/ml)预孵3 h,再加入100μmol/L H2O2培养24 h,分别测定LA对各组细胞活力,IEC抗氧化指标(SOD、GSH-pX和MDA)、功能酶(脂肪酶、淀粉酶)、肠道损伤特异性指标(DAO和LDH)的影响。 结果:1. XO/X损伤IEC模型的适宜浓度为50U/L XO和10μmol/L X,适宜培养时间为24h; H_2O_2损伤IEC模型的适宜浓度为100μmol/ml H_2O_2,适宜培养时间为24h。 2. XO/X(50U/L XO/10μmol/L X)与H_2O_2(100μmol/ml)氧化胁迫下的IEC,细胞活力显著下降(P<0.05),IEC的SOD、GSH-pX、脂肪酶、淀粉酶、二胺氧化酶活性显著下降(P<0.05),细胞培养液中MDA含量显著上升(P<0.05);且50U/L XO对IEC造成的氧化损伤相较100umol/ml的H_2O_2严重。 3. LA可以促进IEC的增殖,显著提高XO/X与H_2O_2两种模型氧化胁迫下IEC的SOD、GSH-pX活性,降低细胞培养液中MDA的含量(P<0.05);同时LA提高了氧化胁迫下IEC分泌的淀粉酶(P<0.05)和脂肪酶(P>0.05)的活性;显著降低了氧化胁迫下IEC培养液中LDH的活性,提高了IEC裂解液和培养液中DAO的活性。……   
[关键词]:大鼠;肠上皮细胞;原代培养;氧化应激;硫辛酸;干预
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:上海交通大学2011年
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