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荧光假单胞菌PCR检测靶点的筛选及PCR检测体系的建立

杨一林

  荧光假单胞菌(PseudomonasFluorescens)是一种嗜冷微生物,在冷藏的生肉、生牛乳等高蛋白高脂肪的食品中是导致腐败的优势菌种。免疫缺陷病患者被荧光假单胞菌感染血液,可能导致败血症等严重后果,属于典型的“条件致病菌”。随着人们生活水平的提高和饮食习惯的变化,荧光假单胞菌对人类健康的潜在威胁日益扩大。建立快速、准确的荧光假单胞菌检测方法对完善食品安全监测体制有重要的意义。 PCR技术因其具有特异性强,灵敏度高,反应快速等优势,已被广泛应用在食源性致病微生物的检测领域。针对荧光假单胞菌的PCR检测仍处于初级阶段。目前检测荧光假单胞菌的种特异性基因靶点很少,且缺乏系统评价。本研究将通过生物信息学手段,寻找新的种特异性的检测靶点,针对这些靶点以及16S-23SrRNA基因间隔区序列与gyrB基因设计和筛选出新的种特异性强的引物,建立和优化荧光假单胞菌PCR检测体系,并对其进行系统评价。 首先通过比对荧光假单胞菌及其它原核生物的基因组序列,发掘出4段荧光假单胞菌特异性片断作为候选分子检测靶点,同时也对16S-23SrRNA基因间隔区序列、gyrB基因进行信息学分析。对上述6个分子靶点分别设计常规PCR引物,并经实际实验特异性初筛,选取gyrB基因为检测靶点,建立常规PCR和荧光定量PCR检测体系,并进行系统评价,结果如下: 1.荧光假单胞菌常规PCR检测体系:1)PCR反应体系的优化:通过对退火温度、Mg2+浓度的优化选择,建立相应的荧光假单胞菌常规PCR检测体系; 2)特异性:经11株荧光假单胞菌和28株非荧光假单胞菌验证,该体系扩增荧光假单胞菌基因组DNA可得到一条271bp的特异性条带,扩增非荧光假单胞菌基因组DNA则无条带; 3)灵敏度:纯DNA检测灵敏度为14.3fg/μL(2~3copies/μL),纯培养物检测灵敏度为3.0×102CFU/mL;向25mL无菌豆奶样品中添加2.2CFU荧光假单胞菌时,增菌15h可检测到阳性结果,整个检测过程可在18h内完成; 4)抗干扰能力:当背景干扰菌总量达到108CFU/mL时,经过15h增菌培养,可准确检测荧光假单胞菌的存在; 5)检出率:5种(56份)实际样品中荧光假单胞菌检出率为19.6%,高于培养法的检出率1.8%。 2.基于TaqMan探针的荧光定量PCR检测荧光假单胞菌体系: 1)PCR反应体系的优化:通过对退火温度、探针浓度的优化选择,建立相应的荧光假单胞菌荧光定量PCR检测体系; 2)特异性:经11株荧光假单胞菌和28株非荧光假单胞菌验证,该体系扩增荧光假单胞菌基因组DNA可采集到Ct值<35的荧光信号,扩增非荧光假单胞菌基因组DNA则无荧光信号或Ct值>35; 3)灵敏度:纯DNA检测灵敏度为14.3fg/μL(2~3copies/μL),纯培养物检测灵敏度为3.0×102CFU/mL;向25mL无菌豆奶样品中添加2.2CFU荧光假单胞菌时,增菌15h可检测到阳性结果; 4)抗干扰能力:当背景干扰菌总量达到108CFU/mL时,经过15h增菌培养,可准确检测荧光假单胞菌的存在; 5)检出率:6种(56份)实际样品中荧光假单胞菌检出率为25%,高于培养法的检出率1.8%和常规PCR检出率19.6%。 本研究建立的荧光假单胞菌常规PCR体系与荧光定量PCR体系可快速、准确的检测食品样品中荧光假单胞菌的存在,值得推广使用。……   
[关键词]:荧光假单胞菌;PCR;靶点;检测;食品
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:上海交通大学2011年
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