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赭曲霉发酵产大黄素及其生物合成途径和诱发机制的研究

吕平

   大黄素(Emodin),1,3,8-三羟基-6-甲基蒽醌,具有抗病毒、抗炎、抗肿瘤、抑菌、扩张血管、免疫抑制等多种生理功能,已经成为一种十分有前途的新型药物单体。目前大黄素的主要生产方式是从药用植物大黄、虎杖中提取,产量低,质量难以控制。而本实验室保藏的一株赭曲霉(Aspergillus ochraceus LP_0201)在自然状态下便可以产生大黄素,为通过工业发酵的方式来高效地生产大黄素提供了可能。 利用制备型HPLC纯化了大黄素单体。制备HPLC的条件为:流动相,甲醇:水(60:40,v/v);进样量,300mg;柱温,室温;流量,60mL/min;检测波长,254nm。通过ESI-MS、ESI-MS/MS、UV-VIS、FT-IR、1H-NMR、13C-NMR和DEPT确证了大黄素的结构。 通过N~+离子注入获得大黄素高产菌株Aspergillus ochraceus LP_0301,并优化了发酵条件,使其最终产率达1.453mg/L,比出发菌株提高2.96倍。优化后的培养基为:镁离子1.5 g/L,硝酸铵10g/L,蛋白胨10g/L,玉米淀粉75g/L;发酵条件为:温度30℃,转数140 r/min,初始pH为7,装液量80 mL(250 mL),接种量10%,菌龄20h。 研究了大黄素提取和精制方法。提取方式为有机溶剂回流法,提取条件为:料液比,1:12;醇浓度,100%;提取时间,1.5h。精制采用D101大孔树脂,上样流速为1.5mL/min,温度为20℃,上样液中大黄素含量为1.0mg/mL。以中性90%乙醇在50℃下,2.0mL/min的速率洗脱。 短链脂肪酸、氨基酸添加和代谢抑制实验表明,大黄素由聚酮途径合成。通过RAPD分析,获得两个差异性扩增片断,一个片断与AY272043.1和AY583208.1同源,证实大黄素通过聚酮途径合成,另一个片断与XM_002374227.1和AY585205.1同源,表明大黄素合成与氧自由基有关。通过HPLC-ESI-MS/MS对13C标记大黄素动态跟踪及13C在大黄素分子中分布,提出了大黄素合成前体物和延伸的单元均是乙酰辅酶A(或其衍生的二碳单位),延伸共进行7轮。通过研究大黄素在细胞外对氧自由基的消除作用和测定发酵过程中SOD、CAT酶活,推测大黄素的诱发机制和生理功能可能是抑制体内氧自由基的增加。……   
[关键词]:大黄素;赭曲霉;RAPD;氧自由基;N~+离子注入
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:天津大学2009年
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