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香豆雌酚的提取分离及人群摄入量评估

宋婉睿

  香豆雌酚(coumestrol),一种酮类香豆素,是紫花苜蓿中主要的植物雌激素,已被现代研究证实具有雌激素样和抗雌激素作用,且对抗癌、防治骨质疏松、降血糖及调节免疫系统等有一定疗效。另外,香豆雌酚还具有缓解由β-雌二醇引起的内皮组织依赖性冠状静脉舒张和抑制SR12813对人体孕烷X受体活性的拮抗等作用。本课题以紫花苜蓿为实验材料,对其中香豆雌酚的提取、分离、纯化等方面进行研究,旨在优化香豆雌酚的提取分离条件,找到一条简单、合理、快速的提取工艺路线,为进一步研究其生理活性提供物质基础。同时,本研究对人群膳食中的香豆雌酚摄入量进行一系列的统计分析,为人群膳食的植物雌激素风险评估提供可靠依据。主要研究成果如下: 1.建立了分光光度法测定紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物含量的方法,经方法学考察证实该方法具有良好的精密度、线性关系、重现性及回收率,适合紫花苜蓿中香豆雌酚粗品的简单快速测定。并以此为检测方法,研究响应曲面法优化紫花苜蓿中香豆雌酚的提取工艺,得到香豆雌酚粗提取的最佳工艺为:在液料比27.28 mL/g,提取温度67.7℃时,采用甲醇回流提取13.77 h,此时紫花苜蓿中香豆雌酚粗提取物得率为2.64‰,与预测值2.62‰的相对误差为0.76%。 2.建立了紫花苜蓿中香豆雌酚的高速逆流色谱分离方法。通过分层时间考察和分配系数测定等溶剂选择方法,得到适合用于紫花苜蓿中香豆雌酚的分离纯化的四种体系:丙酮-正己烷-乙醚-水(2:1:1:1)、(1.5:1:1:1)、(1:1:1:1)和水-N,N-二甲基甲酰胺-丙酮-四氯化碳(2:4:3:5),并对水-N,N-二甲基甲酰胺-丙酮-四氯化碳(2:4:3:5)和丙酮-正己烷-乙醚-水(1.5:1:1:1)两体系进行色谱条件优化试验,经综合比较两体系的优缺点,确定采用此两体系实现两步纯化紫花苜蓿中香豆雌酚的方法。且经纯化后的香豆雌酚样品采用紫外扫描法、液质联用(LC-MS/MS)鉴定,确定产品为香豆雌酚,纯度在97%以上。 3.建立香豆雌酚的LC-MS/MS检测方法,色谱柱是Agilent XDB-C,8柱(4.6×50 mm,1.8μm),柱温是30℃,流动相为乙腈-水(55:45,V:V)等度洗脱,流速是0.35 mL/min,在质谱的多反应监测负离子模式下分析。结果表明:由于香豆雌酚在食品中的含量差别较大,在优选的色谱和质谱条件下,建立四条标准曲线Y=154.6389X+15.8700 (R2=0.991)、Y=102.3375X+134.3646 (R2=0.999)、Y=116.9685X-10809.6435 (R2=0.999)、Y=36.8953X+48246.5312 (R2= 0.995),其线性范围分别是0.4-4 ng/mL、0.8-28 ng/mL、100-600 ng/mL、500-1200 ng/mL;并通过SPSS13.0将四条线性标准曲线拟合成一条非线性标准曲线Y=225.187X3-0.233X2-385.180 (R2=0.997);其检测限为0.107ng/mL,定量限为0.357 ng/mL;经方法学考察证实该方法具有良好的精密度、线性关系、重现性及回收率,能够满足实际样品的检测要求。 4.通过建立香豆雌酚的LC-MS/MS检测方法,对食品的香豆雌酚含量进行检测。并结合人群膳食调查,对人群膳食中香豆雌酚的摄入量进行统计分析。得到总体人群的香豆雌酚摄入量范围为26.282-802.468μg/日,人均摄入量为113.182μg/日,为植物雌激素的人群膳食风险评估提供有效依据。……   
[关键词]:香豆雌酚;植物雌激素;响应曲面法;高速逆流色谱;LC-MS/MS;问卷调查;摄入量评估
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:南昌大学2011年
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