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海洋微生物高通量培养和分选技术的建立及应用

冀世奇

  目前普遍认为海洋微生物能被分离培养的还不到1%,如何快速大量地从海洋环境中获得微生物纯培养成为该学科研究的“瓶颈”。研究发现,经典的平板培养方法不适合于大多数海洋微生物的培养,今后海洋微生物学领域的重要课题之一就是寻找难培养海洋微生物的培养方法。为建立海洋微生物的新的分离培养技术,本论文按以下研究内容展开:包埋活细胞的微球制备技术的建立、海洋微生物高通量培养和分选方法的建立与应用以及一株海洋新菌的分类鉴定。 本论文以活细胞的微包埋为前提,建立了三种微球制备方法,分别为搅拌乳化法、两相共流法和膜乳化法。三种方法均可以采用多种天然高分子聚合物(如琼脂糖、褐藻酸钠和结冷胶)制备出粒径均一的微球,其制备工艺简单、条件温和,适合活生物细胞的包埋。所建立的微球制备技术也可应用于其它领域。 在所建立的微球制备技术基础上,进一步建立了海洋微生物的高通量培养和分选技术。该技术的基本步骤是,首先采集海洋微生物样品,采用离心和滤膜过滤法浓缩微生物,将浓缩的微生物细胞进行微包埋;然后将包埋有微生物的微球装层析柱,模拟微生物的原生态环境,在寡营养条件下对包埋微生物进行流动培养;随后用流式细胞仪对长有微菌落的微球进行分选,并对分选后的微菌落加入营养丰富的海洋培养基继续培养;最后对分离纯化的菌株进行保藏及分类鉴定。通过对一株纯培养细菌及两个海洋样品的包埋、培养、分选和鉴定,验证了该方法的可行性,可有效提高海洋微生物的可培养性。该技术采用所建立的三种适合活细胞包埋的方法,尤其是两相共流法和膜乳化法,改善了微生物的包埋条件,可更好的保证细胞的存活率;该技术除了采用琼脂糖为包埋材料外,还采用海藻酸钠和结冷胶作为包埋材料对微生物进行包埋,包埋基质的不同可能会增加微生物的可培养性;此外,本技术还增加了微生物的包埋数量,可使微生物间的交流更加密切,有助于提高微生物的可培养性。 利用高通量培养分选法和平板分离法分析了极地底泥样品和青岛文昌鱼繁殖区海水及沉积物样品的微生物多样性。用高通量法共分离并保藏菌株500株,其中极地样品350株,文昌鱼繁殖区样品150株;利用平板分离法共分离菌株254株,其中海水样品213株,沉积物样品37株。 对47株高通量法分离极地菌株16S rDNA序列分析结果显示,这些菌株来自6个细菌类群:α-变形菌纲(19)、β-变形菌纲(2)、γ-变形菌纲(17)、放线菌门(2)、厚壁菌门(4)和拟杆菌门(3),共21个属,其中有6株为潜在的海洋细菌新种(16S rDNA序列与已知细菌的相似性小于97%),均来自副球菌属。 对80株高通量法分离的文昌鱼繁殖区海水样品菌株的分析结果显示,分离菌株属于7个细菌类群,分别为α-变形菌纲(26)、γ-变形菌纲(35)、拟杆菌门(9)、放线菌门(4)、厚壁菌门(4)和稀有类群ε-变形菌纲(1)和疣微菌门(1),共41个属,其中13株为潜在的细菌新种。对70株平板法分离文昌鱼繁殖区海水样品菌株的测序结果表明,这些菌株来自4个细菌类群,分别是γ-变形菌纲(57)、α-变形菌纲(6)、拟杆菌门(2)和厚壁菌门(5),共26个属,其中3株为潜在的细菌新种。对文昌鱼繁殖区沉积物样品的全部37株菌的测序结果,发现菌株属于4个细菌类群,分别是厚壁菌门(2)、拟杆菌门(3)、α-变形菌纲(5)和γ-变形菌纲(27),共22个属,其中8株为潜在的细菌新种。 高通量培养分选法与平板分离法的结果比较表明,高通量法获得了更高的微生物多样性,并且能够培养出平板法不能或不易分离到的类群,如ε-变形菌纲和疣微菌门的菌株,提高了微生物的可培养性。利用高通量法使海洋微生物培养和分选效率得到了显著的提高。 对一株分离自文昌鱼繁殖区沉积物的潜在海洋细菌新种JYr13~T进行了分类鉴定。通过形态学、生理生化特征、GC含量测定、醌和脂肪酸含量测定以及API 20NE和BIOLOG快速鉴定系统等对该菌株进行了多相分类。经鉴定,JYr13~T为革兰氏染色阴性,兼性厌氧,棒状,周生鞭毛,可游动,具三价铁和高价硒还原能力,G+C含量为59.1 mol%,主要脂肪酸为C_(16:0),主要醌为甲基萘醌(MK-7)和泛醌(Q-7和Q-8);16S rRNA和gyrB基因序列比对结果显示,其分别与Ferrimonas kyonanensis DSM 18153T和F. marina DSM 16917T亲缘关系最近,相似度分别为为96.0%和81.2%;基于16S rDNA系统发育树的分析也将该菌株与铁单胞菌属(Ferrimonas)归为一簇,并独自成支。因此从系统发育、生理生化特征及化学特征等可以确定其进化地位为一株铁单胞菌属新种,定名为底泥铁单胞菌(Ferrimonas sediminum)。JYr13~T在三个菌种保藏中心的保藏号为DSM 23317~T,GU391222~T和JCM 17552~T。……   
[关键词]:高通量培养和分选;海洋细菌多样性;微球制备;底泥;文昌鱼繁殖区
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国海洋大学2011年