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扣囊复膜酵母菌酸性蛋白酶基因在解脂耶罗维亚酵母菌中表达和重组酸性蛋白酶的应用

于欣君

  酸性蛋白酶,又叫天冬氨酸蛋白酶,是一种在酸性环境下可以将蛋白质分解成多肽或氨基酸的酶类。近年来,酸性蛋白酶广泛应用于生产,特别在乳制品、饲料工业和酒精发酵等方面,具有很大的规模。近年来,由于牛凝乳酶供应量低,价格高和安全性等问题,来自其它物种,如细菌和真菌的牛奶凝固酶作为牛凝乳酶的替代品广泛引起人们的注意。解脂耶罗维亚酵母可以自然分泌大量的蛋白,具有多种用于遗传标记和分子工具,该酵母被认为是安全的。所以能利用解脂耶罗维亚酵母菌表达生产酸性蛋白酶取代牛凝乳酶具有重要的实际意义。 本研究发现扣囊复膜酵母菌(Saccharomycopsis fibuligera)A11菌株具有酸性蛋白酶的活性,但该酶是胞壁酶,不能分泌到胞外。所以为了研究该酶的性质和该酶在牛奶凝固中的应用,从扣囊复膜酵母菌(Saccharomycopsis fibuligera)A11菌株中克隆编码该胞壁酸性蛋白酶的基因APG,并且在解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)Po1h菌株中表达,获得了高重组酸性蛋白酶活性的菌株71。纯化了胞外的重组酸性蛋白酶,并研究其酶学性质。发现该酶分子量大约99 kDa,其最适pH和温度分别是3.5和33℃,并且该酶在pH 1.0到3.0的范围内稳定。该重组酶活性可被Zn~(2+)激活,但被Hg~+、Fe~(2+)、Fe~(3+)、Mg~(2+)、EDTA、碘乙酸和胃酶抑素等抑制。来自重组子71的重组酸性蛋白酶具有很高的牛奶凝固活性,说明可将其作为牛凝乳酶的替代物应用于奶酪工业。 同时把该酸性蛋白酶基因连接到表面展示质粒pINA1317-YlCWP110的多克隆位点中,通过该质粒将酸性蛋白酶展示在解脂耶罗维亚酵母Po1h的细胞表面上,其中展示蛋白酶的细胞在牛奶平板上可以形成透明圈,说明它们具有胞外酸性蛋白酶活性,并且展示酸性蛋白酶的细胞可用于牛奶凝固过程中。并筛选得到无His标签、带6His标签和8His标签的转化子20、20和6,酶活分别是63.7U/OD_(600nm)、42.0 U/OD_(600nm)和25.3U/OD_(600nm)。这些结果说明无His标签的酸性蛋白酶酶活性较高,在实际应用中展示在酵母表面上的酸性蛋白酶不用His标签。将上述转化子应用于牛奶凝固试验中,并优化了牛奶凝固的条件。在pH 3.0, 40°C,加入20 mM的CaCl_2和10%(w/v)脱脂奶粉的条件下,牛奶凝固活性达到最大的1142.9 U/mL。说明酵母细胞表面展示的酸性蛋白酶可以有效地应用于牛奶凝固。 相对于分泌的酸性蛋白酶,表面展示的酸性蛋白酶省去了酶的纯化等过程,可以直接将表面展示有酸性蛋白酶的酵母细胞应用于牛奶凝固过程中,节约了生产时间和成本。所以,表面展示的酸性蛋白酶在食品和奶酪工业中具有很大的潜在应用价值。本研究是关于展示酸性蛋白酶的酵母细胞作用于牛奶凝固的首次报道。 目前,发现不同来源的酵母菌具有很高的蛋白含量,可以用于单细胞蛋白的生产。单细胞蛋白可用于动物的饲料以及人类的食物。源于海洋鱼类肠道的解脂耶罗维亚酵母22a-2,每100g干细胞中含有47.6g蛋白,所以具有用于单细胞蛋白的潜在价值。为了使解脂耶罗维亚酵母22a-2既可以生产单细胞蛋白,又可以生产重组酸性蛋白酶用于牛奶凝固,将来自扣囊复膜酵母菌A11菌株的酸性蛋白酶基因在解脂耶罗维亚酵母22a-2中表达,所产的重组蛋白酶用于牛奶凝固中,并且重组酵母菌仍保持很高的蛋白含量。由该重组酸性蛋白酶水解酪蛋白产生的蛋白质水解产物与牛凝乳酶水解酪蛋白产生的蛋白质水解产物在大小方面一致,说明该重组酸性蛋白酶凝固牛奶的机理可能与牛凝乳酶的一致。……   
[关键词]:扣囊复膜酵母;解脂耶罗维亚酵母;酸性蛋白酶;牛奶凝固;酵母表面展示;基因敲除
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国海洋大学2011年