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菊花品种“日本红”的脱毒处理及健康检测方法研究

杨鹏辉

  针对危害菊花的主要病毒——菊花B病毒(Chrysanthemum virus B,CVB),本文采用药剂处理、热处理、超低温处理等脱毒技术,利用双抗夹心酶联免疫吸附方法(DAS-ELISA)和RT-PCR技术检测病毒,进行脱除CVB病毒和脱毒苗健康评测研究,并对现有的脱毒方法和脱毒苗的检测技术进行评价。以经过检测携带CVB病毒的菊花品种“日本红”组培苗为母株扩大繁殖,作为实验材料。主要结果如下: (1)参照文献资料,选择适宜的环境条件并以MS培养基作为基本培养基来建立菊花快速繁殖体系。实验结果表明,外植体污染率受到温度和季节的影响,用0.1%升汞溶液对“日本红”茎段消毒6 min效果最佳。最佳初代培养基是MS+BAl mg/L+NAA0.5mg/L;最佳继代培养基是MS+BAl mg/L+NAA0.1mg/L;最佳生根培养基是1/2MS+NAA0.1mg/L. (2)作为对照实验的单独茎尖培养脱毒,经DAS-ELISA和PCR进行综合检测,结果脱毒率为零,说明仅仅依靠茎尖培养不能够脱除CVB病毒。 (3)选用二硫脲嘧啶和病毒唑两种药剂结合茎尖培养脱毒,二硫脲嘧啶和病毒唑均设置四个浓度。结果表明,经过这两种药剂处理后的组培苗经过ELISA检测病毒含量均有所下降;而四种浓度的二硫脲嘧啶对菊花组培苗的毒害都过大,脱毒效果不明显;四种浓度的病毒唑对菊花组培苗的毒害甚小或没有毒害,脱毒效果极佳。病毒唑脱毒效果最佳的是4mg/L的浓度,达到88.2%。 (4)热处理技术选用3个温度梯度和5个时间梯度进行试验。结果表明,经过热处理后的组培苗经过ELISA检测病毒含量均有所下降;在Day/Night:36℃,12h/30℃,12h条件下热处理30天能够取得最佳的脱毒率和茎尖萌发率,分别为81.2%和80%。 (5)采用玻璃化法和包埋玻璃化法两种超低温技术技术结合茎尖再生培养进行脱除菊花B病毒的实验。结果效果不佳,仅有PVS2处理40min的玻璃化法获得25%的再生茎尖存活率。包埋玻璃化法由于PVS2处理时间不当或是低温炼苗不够等原因没有取得存活的茎尖。 (6)综合ELISA和RT-PCR两种检测方法来确定脱毒苗,先用ELISA方法进行筛选,然后再将疑似阳性的样品进行RT-PCR检测。结果,筛选出PCR检测最佳的退火温度是62℃,对ELISA检测的P/N比值接近2的菊花样品检测的结果大多为阳性,说明RT-PCR方法比ELISA方法更灵敏。 综合以上结果可以看出,经过热处理和药剂处理后的组培苗ELISA检测的病毒含量均有所下降;4mg/L浓度的病毒唑进行药剂处理和Day/Night:36℃,12h/30℃,12h条件下热处理30天都是很好的脱毒方法;而超低温处理技术在解决了茎尖的再生成活这个关键问题后前景广阔;RT-PCR方法是比ELISA方法更灵敏的检测方法。……   
[关键词]:菊花;CVB病毒;脱毒处理;检测技术
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:四川农业大学2011年