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SLE患者骨髓MSC成骨分化机制研究

汤郁

  成人的骨代谢是骨形成和骨破坏的动态平衡的过程。目前研究认为系统性红斑狼疮(SLE)患者肿瘤坏死因子(TNF)-α为主的炎症因子介导的破骨细胞过度增殖、活化和成熟是导致SLE患者骨质疏松的主要原因,但尚缺乏SLE患者成骨细胞状态的研究。成骨细胞来源于骨髓间充质干细胞(BMMSCs), TNF-α对正常人BMMSCs的作用目前仍存在争议:在体外可能通过活化NF-кB或其他信号通路抑制或活化骨形态发生蛋白-2(BMP-2)诱导的间充质干细胞(MSCs)向成骨细胞分化,亦有报道在体外对MSCs的成骨分化起抑制作用。我们前期研究发现SLE患者BMMSCs在普通成骨诱导分化培养基中成骨分化能力下降,推测SLE患者TNF-α可能通过活化NF-кB或其他途径抑制BMMSCs的BMP/Smad信号通路从而参与骨质疏松的病理过程。 多个信号通路包括BMP、Wnt、Notch等参与了BMMSCs的成骨分化的调节,为研究SLE患者BMMSCs参与成骨的信号通路,我们分离了培养了4例SLE患者和4例健康对照者的BMMSCs,提取RNA并逆转录为cDNA,每张芯片以Cy3标记的样本cDNA作为探针,Cy5标记的人标准品cDNA作为探针,在表达谱芯片上进行杂交,将SLE患者BMMSCs 2万余基因与正常相比进行比较,并利用qRT-PCR、Western blot及免疫组化对芯片的结果和TGF-β、MAPK及细胞周期蛋白调控信号通路的差异蛋白进行验证。结果按差异显著性筛选出SLE BMMSCs差异基因1905个,其中上调的652个,下调的有1253个;基因本体论(Go)分析显示,差异基因主要表现于细胞周期和蛋白粘附功能;信号通路(Pathway)分析显示,差异明显的信号通路主要为细胞微丝骨架、局部粘附、紧密连接和TGF-β/BMP信号通路。SLE BMMSCs BMP/TGF-β信号通路异常、细胞周期蛋白E (CyclinE)的蛋白表达减少、MAPK/Junk、MAPK/ERK信号通路较正常活化。而在可探知的BMP信号通路的25个基因中,差异表达基因19个,除BMP-5上调外,其余18个基因均下调,提示该通路处于抑制状态。 BMP信号通路的信号通过其受体磷酸化Smadl/5/8蛋白,并与Smad4形成复合物入核,启动相关基因的转录。为研究SLE患者BMMSCs BMP信号通路状况,用Western blot方法验证了SLE BMMSCs BMP/Smad信号通路的蛋白的功能,结果发现:SLE BMMSCsBMP受体BMPRIA与正常无异,但磷酸化的Smad1/5/8 (pSmad1/5/8)低于正常,Smad1/5/8与Smad4形成的入核复合物较正常减少。以上证实SLE BMMSCs的BMP/Smad通路处于抑制状态。 为研究SLE患者BMMSCs BMP-2诱导成骨分化情况,将细胞在含BMP-2的成骨分化培养基中培养,检测其成骨基因碱性磷酸酶(ALP)及成骨相关转录因子Rux2的表达及细胞外矿化情况。结果显示:SLE患者BMMSCs BMP-2诱导下48小时ALP及Rux2表达、14天ALP活性及21天细胞外基质矿化均低于正常,提示其成骨能力下降。 为研究TNF-a对BMMSCs成骨分化的影响,用TNF-a处理BMP-2诱导下的正常人BMMSCs,发现TNF-a可活化NF-кB信号通路,表现为IкB的减少;同时TNF-a可抑制BMP-2诱导的Smad1/5/8的磷酸化;而NF-кB的抑制剂PDTC可拮抗TNF-α诱导的Smadl/5/8的磷酸化;TNF-a作用48小时可抑制BMP-2诱导下的正常人BMMSCs的ALP及Rux2表达;作用21天可减少细胞外钙盐沉积。 进一步研究显示,SLE BMMSCs NF-κB信号通路中pIкB增多,而IкB减少,提示该通路处于活化状态;进而,用NF-KB的抑制剂PDTC处理SLE患者的BMMSCs,细胞pSmad1/5/8增加、BMP-2诱导下48小时ALP及Rux2表达及21天细胞外基质矿化均部分恢复。 通过以上研究,可以做出以下结论:SLE患者BMMSCs BMP/Smad信号通路处于抑制状态而NF-кB信号通路异常活化;SLE患者TNF-α通过活化的NF-кB途径抑制BMMSCs的BMP/Smad信号通路,从而使其BMP-2诱导的成骨分化减弱。 我们的研究揭示了SLE患者BMMSCs的BMP/Smad及NF-кB信号通路状态;提出SLE患者TNF-α作用于BMMSCs抑制其成骨分化参与骨质疏松的新的理论,并阐明其信号通路调控机制,为治疗SLE患者骨质疏松新靶点药物的选择提供了理论基础。……   
[关键词]:红斑狼疮;系统性;骨髓;间充质干细胞;信号通路;成骨分化;骨质疏松
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:南京中医药大学2011年