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四物汤类方用于妇科血瘀证原发性痛经的物质基础与配伍规律研究

刘培

  本论文研究工作为“江苏省高校自然基金重大基础研究资助项目—四物汤类方治疗妇科血瘀证原发性痛经的物质基础与配伍规律研究”的部分研究内容。论文分六个章节讨论。 一、文献研究。 该部分对相关文献进行整理,较系统地综述了四物汤类方治疗妇科血瘀证原发性痛经的传统与现代认识,并对香附四物汤配伍效应及其物质基础研究进展进行综述。 二、在综合分析文献的基础上,理出研究思路,设计可行的实验方案和技术路线。 三、通过知识挖掘描述香附四物汤的组方结构与特点。 基于文献数据挖掘,对香附四物汤组方原则及配伍规律进行探讨分析;从中医方剂数据库中检索出包含香附-延胡索等五个药对治疗痛经的方剂,建立数据库,对其出现频率进行统计分析。结果,香附四物汤方中的当归、香附和延胡索相似度较高,是本方主要组成单元;在154首治疗痛经的方剂中,香附-当归药对使用频次较高,香附-延胡索药对最常与四物汤配合运用。 四、香附四物汤的的效应评价与物质基础研究。研究内容包括以下几个方面: (一)气滞血瘀证原发性痛经效应评价体系的建立与应用。 1.以香附四物汤临床传统用药形式—汤剂为研究对象,采用水煎煮的方法进行提取,并对其挥发性成分进行收集;在强调汤剂作为方剂整体作用物质的基础上,又采用现代分离技术大孔吸附树脂法对其不同化合物类型进行纯化富集,制备得15个样品供生物效应评价及成分分析,以期探讨生物效应、效应物质及其两者之间的关系。 2.选择离体器官模型(离体子宫收缩模型)、整体动物模型(原发性痛经模型)对香附四物汤及各分离部位进行生物效应评价,香附四物汤、醇沉上清液部位和60%乙醇洗脱部位均呈现出对子宫收缩的明显抑制活性。采用HPLC法对60%乙醇洗脱效应部位中主要化学成分进行定量分析,结果分析测定了效应部位中6个主要化学成分(即四氢非洲防己碱、普鲁托品、紫堇碱、延胡索乙素、四氢黄连碱、小檗碱)的含量。通过离体子宫收缩模型的效应验证,表明化合物组能够较好的代表效应部位的效应,提示香附四物汤治疗气滞血瘀证原发性痛经的效应部位中抑制小鼠离体子宫收缩的主要效应成分主要为生物碱类化合物,小檗碱对缩宫素诱导的离体子宫收缩抑制效应最强。 3.选择小鼠脾淋巴细胞增殖与转化实验对香附四物汤及各分离部位进行免疫相关的生物效应评价,香附四物汤、醇沉上清液部位和30%乙醇洗脱部位具有促进小鼠脾淋巴细胞增殖与转化作用。采用HPLC法对30%乙醇洗脱效应部位中主要化学成分进行定量分析,结果分析测定了效应部位中4个主要化学成分(即芍药内酯苷,芍药苷,阿魏酸和洋川芎内酯Ⅰ)的含量。将化合物组与活性部位进行效应验证,表明化合物组能够较好的代表效应部位的效应,提示芍药内酯苷,芍药苷,阿魏酸和洋川芎内酯Ⅰ是该活性部位的主要活性成分,香附四物汤与四物汤在免疫增强活性中有共同的物质基础。 4.选择急性血瘀大鼠模型从血液流变学、内分泌激素等多方面对香附四物汤及分离部位进行生物效应评价,主要研究结果有香附四物汤及其醇溶部位能有效改善急性血瘀SD大鼠全血黏度、血浆黏度、血沉等病理变化,延长TT、APTT,降低纤维蛋白原含量,对卵巢功能也具有一定改善作用,而醇沉部位对血液流变性各项指标影响较弱。 5.通过脑微透析色谱联用技术研究香附四物汤对痛经模型大鼠脑神经递质的影响,结果表明香附四物汤在下丘脑阻断5-HT转变为5-HIAA。 (二)香附四物汤与基本方用于妇科血瘀证原发性痛经的配伍特点分析。 选择整体动物模型(气滞血瘀大鼠模型,血虚小鼠模型,热板致痛小鼠模型,醋酸致痛小鼠模型,原发性痛经小鼠模型)等从血液流变学、内分泌激素、动物行为学等多方面对香附四物汤和基本方进行生物效应评价和比较分析。主要研究结果为: 1.气滞血瘀SD大鼠模型研究结果表明,香附四物汤能够明显改善气滞血瘀模型大鼠血液流变学指标,而基本方干预的气滞血瘀模型大鼠血液流变学指标改善不明显。 2.血虚小鼠模型研究结果表明:香附四物汤干预的血虚小鼠模型改善外周血象作用不明显,基本方更有利于调节机体免疫功能,促进造血功能的恢复。 3.热板致痛小鼠模型,醋酸致痛小鼠模型和原发性痛经小鼠模型研究结果表明:香附四物汤在这三个模型上表现的生物效应优于基本方,香附四物汤在抑制痛经作用中以镇痛为主。 (三)香附四物汤方药物质基础研究。 1.香附四物汤组成药味之一—香附的水溶性成分分离与鉴定,通过色谱分离技术,从香附60%乙醇提取物中分离得到一个新的脑苷,对其波谱数据进行分析,该化合物被鉴定为1-O-(β-D)-glucopyranosyloxy)-(2S,3R,4E,8Z)-2-[(2 R)-2 -hydroxylignoceranoylamino]-4, 8-tetradecene-3-diol,并具有抑制血管平滑肌细胞增殖的作用。 2.采用UHPLC-DAD-ESI-MS法、通过标准化合物对照及质谱特征分析对香附四物汤中的主要色谱峰进行了归属和指认,分析鉴定了其中包括芳香酸、苯酞类、含氮化合物、萜类、糖等化合物类型的34个化合物,为阐明香附四物汤的效应物质提供了依据。 3.采用HPLC法对香附四物汤醇沉上清部位小分子活性成分进行定量分析,结果分析测定了没食子酸、绿原酸、芍药内酯苷、咖啡酸、芍药苷、四氢非洲防己碱、普鲁托品、阿魏酸、延胡索乙素、小檗碱等10个化学成分的含量,为进一步阐明活性部位中各成分与药效相关性研究提供参考。 4.通过苯酚/咔唑-硫酸法测定了香附四物汤醇沉沉淀部位的多糖含量,为明晰部位与药效相关性研究提供参考。 五、香附四物汤用于模型动物与人体的效应机理与代谢特征研究。 (一)香附四物汤对模型动物与人体的神经-内分泌-免疫网络指标的影响。 1.通过临床试验,得出结论:香附四物汤对气滞血瘀证原发性痛经患者有治疗作用,血瘀证原发性痛经的发生与神经-内分泌-免疫网络的各因子变化密切相关,香附四物汤对网络内的(β-EP.E2、T、外周血象等指标具有调控作用。 2.对模型动物的实验研究,得出以下结果:香附四物汤(1)在下丘脑阻断5-HT转变为5-HIAA;(2)促进卵巢颗粒细胞的增殖;(3)直接抑制OT诱导的在体/离体子宫强烈收缩,显著升高痛经小鼠子宫组织中NO水平,且降低子宫组织中钙离子水平,提高SOD酶活力;(4)改善血瘀大鼠血液流变学病理变化,抗凝血酶活性;(5)在内分泌系统,纠正病理状态下机体的E2,P异常水平,抑制COX-2酶活性;(6)在免疫系统,促进脾淋巴细胞增殖,抑制LPS诱导的巨噬细胞NO释放。临床试验与模式动物实验的结果相互补充,证实了课题假说:四物汤活血类方具有特定的配伍关系及内在规律,其治疗妇科血瘀证痛经是通过共有/各异性效应物质对神经—内分泌—免疫网络的调控和/或直接作用于靶器官而实现其整体调节作用,达到标本兼治的目的。 (二)香附四物汤用于原发性痛经模型动物的UHPLC-MS代谢组学初步研究。 在缩宫素诱导的原发性痛经大鼠模型中,前列腺素和类花生酸类物质含量升高,溶血磷脂降低,香附四物汤对原发性痛经的抑制作用与LPC代谢通路有关。 (三)香附四物汤在模式动物与人体内的代谢过程与特征研究。 1.使用UHPLC-Q-TOF-MS联用技术,通过MetaboLynxTM软件处理快速分析了香附四物汤醇沉上清部位在大鼠血浆、尿液、胆汁中的代谢物,从香附四物汤给药后大鼠的尿液、胆汁和血浆中找到45个代谢物,包括羟化、甲基化、磺化、葡糖醛酸化、半胱氨酸化、去甲基化、失氧等多种类型;快速分析了香附四物汤60%乙醇洗脱部位中部分生物碱在大鼠组织中的代谢组分。从大鼠组织中共鉴定分析了包括原型化合物在内的16个成分,从结果可以看出,该部位中的生物碱原型及其代谢物广泛分布于各组织器官,甲基化、去甲基化、磺化、单葡糖醛酸化、磺化与葡糖醛酸化结合是该部位中生物碱的主要代谢类型; 2.使用UHPLC-Q-TOF-MS联用技术,通过MetaboLynxTM软件处理快速分析了香附四物汤在人尿液和血浆中的代谢组分,从服用香附四物汤配方颗粒的气滞血瘀证原发性痛经患者的尿液、和血浆中找到60个代谢物,包括羟化、甲基化、磺化、葡糖醛酸化、半胱氨酸化、去甲基化、失氧等多种类型,人和大鼠在代谢过程中有一定的相似,使用大鼠的代谢转化实验对临床人体代谢实验有一定的指导意义。 六、类方配伍及其规律的关联研究。 (一)组方配伍规律研究。 1.采用计算机聚类分析方法,结合实验研究结果对香附四物汤效应物质基础和配伍效应的相关性进行关联分析。 2.采用正/反向效应评价相结合的研究思路与方法探讨香附四物汤中主要药对的作用特点及对整方的贡献。通过整体动物模型(小鼠热板法、醋酸致小鼠扭体反应、小鼠原发性痛经模型和小鼠血虚模型),评价各给药组对不同模型小鼠的影响。结果香附-延胡索药对表现出很强的镇痛效果,当其在香附四物汤组方中被剔除后作用明显减弱或消失,而香附-当归药对的镇痛效果相对较弱,当其在香附四物汤组方中被剔除后作用没有明显减弱,有的甚至有所提高。香附-当归药对具有很强的补血效应,而香附四物汤以及当其在香附四物汤组方中被剔除后,其均未表现出明显的补血作用。在香附四物汤中,香附-当归的补血作用减弱,而香附-延胡索的镇痛作用依然显著。采用HPLC-PAD法分析药对配伍对香附四物汤中芳香酸类和含氮化合物溶出的影响,通过比较各组响应峰面积,可以看出,香附四物汤中的生物碱类化合物主要由香附-延胡索药对提供,该药对与方中其他药味配伍之后,部分生物碱含量有所增加,叔胺型生物碱在配伍前后量的变化不显著。香附-延胡索药对配伍抑制了有机酸类成分的溶出而香附-当归药对配伍则促进其溶出。 (二)四物汤类方治疗不同证型原发性痛经的作用特点分析。 四物汤类方(少腹逐瘀汤和香附四物汤)针对不同证型原发性痛经(寒凝血瘀证和气滞血瘀证)的治疗中,对神经-内分泌-免疫网络内的效应指标的作用具有共有规律,其对各自证型的效应指标的影响具有各异性。……   
[关键词]:香附四物汤;妇科血瘀证;原发性痛经;生物效应;物质基础
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:南京中医药大学2011年