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水生栖热菌海藻糖合酶体外定向进化及重组菌BL35细胞透性化技术研究

刘俊梅

  海藻糖是一种广泛分布于细菌、真菌和动植物体内的双糖。在生物体内,它不仅作为结构成分和能量物质存在,而且在热击和脱水等协迫条件下,对生物体和生物大分子起着良好的非特异性保护作用。由于其独特的生物学功能,使它广泛用于食品、医药、化妆品、农业、冷藏等方面,具有广阔的市场应用前景。 海藻糖(Trehalose),α-D-(?)比喃葡糖基(1→1)α-D-吡喃葡糖苷,是由两个葡萄糖残基通过一个α,α(1→1)糖苷键连接而成的非还原双糖。海藻糖合酶通过分子内转糖基作用将α,α-1,4糖苷键连接的麦芽糖,转化为α,α-1,1糖苷键连接的海藻糖,是酶法生产海藻糖的关键酶。现有多数海藻糖合成酶转化效率不高、热稳定性较差、反应时间较长等。因此,对其的研究显得尤为重要。 本研究首先克隆表达了海藻糖合酶基因,并从理性和非理性角度对海藻糖合酶进行了分子改造,以海藻糖合酶(trehalose synthase from Pyrococcus horikoshii)晶体结构为模板,在网站S WIS S-MODEL上对来自水生栖热菌FL-03(thermus aquaticus FL-03)海藻糖合成酶进行同源建模,结合分析不同来源的海藻糖合成酶基因的保守序列,选择了保守区的位点A197和H100进行定点(饱和)突变,并在保守区外的S547和H305,进行定点突变,获得高酶活突变体重组菌,并在此基础上进行细胞透性化技术的研究,促使重组菌细胞形成高效的固定化酶系统,大幅提高产率,同时简化工艺,降低生产成本,为工业化生产提供可行性依据。 主要取得的结果表明: (1)采用巢式PCR法成功克隆并高效表达了水生栖热菌的海藻糖合酶基因TresC01。并通过同源建模获得了该重组酶的三维结构信息,预测了该酶的活性中心。 (2)通过同源建模获得了该酶的三维结构信息,活性中心的与底物结合的4个氨基酸残基中的A197、H100、H305和S547与该酶的催化活性有关,通过三维建模后,初步分析4个氨基酸残基变化可能影响海藻糖合酶的酶学性质。 (3)以克隆得到的海藻糖合酶基因T-TersC01为模板,通过PCR介导方法对海藻糖合酶基因进行饱和突变研究,结果显示A197和H100分别饱和突变为其它的19个氨基酸后,共获得了13个突变子,只有突变体pEA197H具有较高的活性其他均无活性;突变体pEA197H比酶活提高了1.52倍。 (3)结合ProSa理性设计,对H305和S547进行了定点突变,结果显示对H305和S547定点突变氨基酸His→Cys和Ser→Cys后酶活下降,降低为野生型(WT)的66%.S547变体没有明显变化,pEH305C比活力与野生型(WT)相比提高1.40倍。 (4)通过对野生型和突变型海藻糖合酶进行三维结构分析及将其与三维结构已知的海藻糖合酶(Pyrococcus horikoshii)进行比较,该海藻糖合酶同样具有(β/α)_8的桶状结构,符合大多数α/β桶酶的活性中心的定位;并探讨了它们酶学性质差异。推测酶活性中心处的催化氨基酸为A197、H305,同时具有α-淀粉酶家族的同源性。 (5)海藻糖合酶高通量筛选体系 采用高拷贝的克隆载体XL10-gold成功获得41个克隆载体,根据利用α互补法(蓝/白菌落筛选法)的直观反应,建立了一套海藻糖合酶高通量克隆载体筛选体系;同时采用DNS-ELISAM酶标法(糖化酶显色法)筛选在的高酶活突变酶,该方法可以大大降低背景的影响,简捷、高效。属于本实验室首创。 (6)透性化细胞可省略酶的纯化和胞内酶的固定化。研究了不同表面活性剂曲拉通X-100(TRITON X-100)、二甲基亚砜(DMOS)和十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)对海藻糖合酶重组菌LB35细胞壁通透性的影响,低分子量物质的渗透障碍被部分或完全解除。结果表明:CTAB、TRITON-X100、DMOS对透性化细胞合成海藻糖活性都有提高作用,高浓度时CTAB和TRITON-X100对海藻糖合酶重组菌LB35具有明显抑制作用,其中DMOS对海藻糖合酶重组菌LB35在1.0%浓度范围内菌体生长抑制作用不是很明显,CTAB抑制较明显。而在细胞培养20h加入0.8%浓度TRITON-X100处理的透性化细胞,海藻糖酶活力提高了2.25倍。TRITON X-100对提高细胞通透性有较好的影响,能较大程度的提高海藻糖合酶重组菌LB35的细胞膜的通透性,促使麦芽糖进入细胞内部更充分的与胞内分泌的海藻糖合酶接触反应,进一步提高海藻糖产量。 通过对这些突变酶的性质变化分析和比较,进一步为研究海藻糖合成酶结构和功能的关系提供理论数据和信息,从而对海藻糖合成酶的分子改造提供理论依据。在国内外有关海藻糖合酶理性和非理性酶分子改性的系统研究还未见文献报道,本研究是首次开辟了这一领域的研究,为深入了解海藻糖合酶性质与结构的关系以及生物法高效生产海藻糖奠定了良好的基础。……   
[关键词]:水生栖热菌FL-03;海藻糖合成酶;克隆表达;定向进化;细胞透性化技术
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:吉林农业大学2011年