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黏菌主要类群营养体阶段发育特点及系统发育关系的研究

陈小姝

  黏菌是一类特殊的真核生物,广泛分布于自然界,其生活史十分特殊,同时具有动物和真菌的特征。在营养生长阶段,产生无细胞壁的原生质团,进行蠕动及摄食行为(类似动物);在繁殖阶段,产生具有明显细胞壁的孢子和特定的子实体(类似真菌)。目前黏菌归属于原生动物,但是黏菌究竟是与真菌的亲缘关系近,还是与原生动物的亲缘关系更近,始终是生物分类学者热衷讨论的一个课题。本研究通过对黏菌主要类群营养阶段的发育特点及系统发育关系的探讨,从宏观到微观,从个体发育到系统发育关系,为揭示黏菌的起源与演化提供理论依据。 本研究对长春地区的黏菌进行调查并采集到标本共计2000余份,通过形态特征鉴定为5目7科23属59种。团毛菌科、绒泡菌科和发网菌科所包含的种最多,共计49种,占长春地区黏菌总种数的83.1%。团网菌属、绒泡菌属和发网菌属所包含的种最多,共计28种,占总种数的47.5%。从基质种类来看,生长在腐木上的种类最多,而且基质对黏菌的生长有影响,可以初步判断黏菌对于基质具有一定的选择性。团网菌属,绒泡菌属和发网菌属的黏菌可以适应多种基质生长,营养需求宽泛,生长范围广。 对所采集的绒泡菌目8种黏菌原质团进行了液体培养研究,根据单因素实验确定了各种的适宜培养基和培养条件。最适宜培养基为燕麦液体培养基。利用正交实验,得到了液体培养的最优条件:淡黄绒泡菌(Physarum melleum) pH9.0,26.5℃,110r/min;全白绒泡菌(P. globuliferum)pH 9.0,26.0℃,1OOr/min;扁绒泡菌(P. compressum)pH4.0,25.5℃, 100r/min;灰绒泡菌(P.cinereum) pH8.0,25.5℃,100r/min;小绒泡菌(P.pusillum) pH 5.0,26.5℃,110r/min;两瓣绒泡菌(P.bivalve) pH 6.0,25.5℃,90r/min;灰堆钙丝菌(Badhamia cinerascens) pH 7.0,26.0℃, 100r/min;黑柄钙皮菌(Didymium nigripes) pH 9.0,25.0℃,110r/min。绒泡菌目的最适的温度在25.0~26.5℃,最适pH在4.0~9.0,转速在100-110r/min之间。为黏菌原质团的液体培养奠定了基础。 对绒泡菌属4种黏菌的原质团进行液体培养,将得到的原质团使用液体培养和有饲培养相结合的方法对原质团进行了诱导孢子果的研究。使原质团在饥饿条件下,通过对光照和温度的调节,在燕麦固体培养基上获得了淡黄绒泡菌(Physarum melleum)孢子果和菌核、全白绒泡菌(P. globuliferum),扁绒泡菌(P. compressum)和小绒泡菌(P. pusillum)的孢子果。产生孢子果的最佳条件为:淡黄绒泡菌26℃,6000 1x,全白绒泡菌24℃,60001x,扁绒泡菌20℃,6000 1x,小绒泡菌22℃,6000 1x;获得菌核的最佳条件为:淡黄绒泡菌22℃,3000 1x。在燕麦液体培养基上,获得了淡黄绒泡菌(Physarum melleum)菌核,全白绒泡菌(P. globuliferum)、扁绒泡菌(P. compressum)和小绒泡菌(P. pusillum)的子实体。产生孢子果的最佳条件为:全白绒泡菌20℃,6000 1x,扁绒泡菌20℃,6000 1x,小绒泡菌22℃,6000 1x;获得菌核的最佳条件为:淡黄绒泡菌22℃,6000 1x。通过固体培养与液体培养条件的比较可以看出,在液体培养基中形成孢子果的温度要比固体培养时的温度低些,且在固体培养基上可以获得较多黏菌孢子果。 在此基础上,首次完成了小绒泡菌从孢子到孢子的全部生活史过程。孢子在松针营养液中26℃下1~2d萌发,10~12d长出原质团,20d左右青白色的原质团布满整个培养皿,将带有大量原质团的培养皿放入培养箱低温培养(20℃),并以散射光刺激孢子果的形成。成熟的小绒泡菌孢囊会在成熟后20天左右开裂,释放出的孢子具有繁殖能力,可继续萌发并形成原质团。完成从孢子到孢子的过程至少需要44d。 形态学特征在某种程度上也会反应系统进化的趋势,如原质团类型,子实体形态,孢丝和石灰结特征等。本实验结合黏菌营养阶段的发育特征,对采集到的黏菌进行核糖体小亚基、线粒体16S rDNA基因和延长因子基因的系统发育关系比较分析,探讨属及属以上分类单元的进化关系。 测定了无丝菌目、团毛菌目、绒泡菌目和发网菌目的5种黏菌(灯笼菌,金孢盖碗,煤绒菌,淡黄绒泡菌,草生发网菌)的核糖体小亚基的部分序列,并结合Genebank下载的29条序列进行了比对。用NJ法对34条序列构建系统发育树。从系统发育关系可以看出,孢子外生的鹅绒菌目单独在一个分支位于系统树的底部,绒泡菌目仍然表现出一目二科的分类体系,孢子暗色的绒泡菌目和发网菌目互为姊妹群,团毛菌目比发网菌目和绒泡菌目较早分化出来,绒泡菌目为较高级的分类类群。 对4目5科11属12种黏菌线粒体16S rDNA基因的部分序列进行了测定,并在Genebank上进行了注册,注册号为JF339204至JF339215。利用软件MEGA 5.0构建MI系统树和NJ系统树,可以看出12种黏菌被分为3大组:鹅绒菌科(Ceratiomyxaceae)、绒泡菌科(Physaraceae)和钙皮菌科(Didymiaceae)、团毛菌科(Trichiaceae)和发网菌科(Stemonitaceae)。利用形态学与系统学相结合的方法对其进行分析得出:孢子外生的鹅绒菌目独立在一个分支上,位于系统树的底部。显型原质团(绒泡菌目)与非显型原质团(发网菌目,团毛菌目及鹅绒菌目)处于不同的分支上。孢丝密集的发网菌科和团毛菌科聚在一起。这一结果与核糖体小亚基序列分析略有不同。 此外还对4目11种黏菌的肌动蛋白基因和延长因子基因的部分序列进行了测定及相关蛋白质序列的分析,共得到13条序列,其中肌动蛋白基因4条,延长因子基因9条,对延长因子基因的9条序列构建NJ系统树,绒泡菌目的进化最快,且分为2大类,高杯菌属,煤绒菌属和针箍菌属为一类,绒泡菌属和白柄菌属为一类。对肌动蛋白基因的4条序列进行ORFs的寻找及翻译,并进行BLASTp比对,其蛋白家族属于肌动蛋白家族。同时对黄垂网不同生长时期(幼孢囊和成熟孢囊时期)的肌动蛋白基因的部分序列进行比对,同源性在99%以上,具有的氨基酸数量相同,都为19种,没有色氨酸。丝氨酸含量最高为10.476(平均值),组氨酸含量最低为0.9524(平均值)。在不同生长时期的黄垂网的氨基酸含量,除丙氨酸,苯丙氨酸,异亮氨酸和脯氨酸外,其他氨基酸含量均相同。 在此基础上,对2目5种黏菌的联合基因序列(SSU基因、16S rDNA基因和EF-1c基因)以及4目6种黏菌的联合基因序列(SSU基因和16S rDNA基因)系统发育树进行了分析,从联合数据集构建的系统发育树来看,绒泡菌目的进化速率较快,结合形态学,孢子外生的鹅绒菌目单独在一个分支上,具有表面网结构的发网菌目和团毛菌目互为姊妹群。与前面单个基因所构建的发育树相比,在一些亲缘关系较近黏菌的分类地位明显地提高了分支的支持率。 以上研究为黏菌原质团的液体培养奠定了基础,并对黏菌系统起源和演化的基础资料进行了补充,由于实验材料有限,有些类群有待进一步进行研究,以揭示黏菌的属间及种间的亲缘关系。……   
[关键词]:黏菌;液体培养;原质团;线粒体;分子系统发育学
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:吉林农业大学2011年