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Serratia marcescens SYBC 08的筛选、鉴定及其发酵产过氧化氢酶的研究

曾化伟

  过氧化氢酶(Catalase, CAT)通过催化一对电子的转移最终将H_2O_2分解为H2O和O2。其广泛应用于食品、纺织、造纸、环保等行业。因此,研究微生物发酵生产CAT具有一定的理论价值和潜在的应用前景。 论文研究了产CAT菌株的筛选,经透射电镜观察、脂肪酸等生理生化观测和16S rRNA基因序列分析鉴定了一株高产CAT的细菌。考察了其发酵产酶条件,研究了发酵产酶调控方法、产酶生理、进行了酶的纯化与性质研究,克隆了该酶基因并进行了序列分析,取得了如下主要结果: 分别采用H_2O_2富集生长法和H_2O_2起泡检测法,从37份土壤和污泥样品中,共筛选获得141株潜在的CAT高产菌。用H_2O_2起泡检测法从纺织厂漂洗车间含H_2O_2污泥中筛选获得一株CAT产量最高的菌株。在LB培养基平板培养48 h后,菌落为紫红色、圆形、光滑、湿润,表面隆起呈金属光泽,边缘整齐或不整齐,有轻微异味,色素不扩散到培养基中。该菌株有丙酮酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶,无精氨酸双水解酶。菌株能利用蔗糖、木糖、阿拉伯糖、乳糖、山梨醇,但不能利用L-鼠李糖、纤维二糖、蜜二糖。经透射电镜观察,这株菌能产圆形或棒形芽孢。主要的脂肪酸含量为C17:0 CYCLO (17.3 %),C_(16:0) (14.8 %),C_(10:0)3OH (10.0 %),C_(17:0) CYCLO (17.3 %),C_(14:0) (6.0 %)。经16S rRNA基因序列鉴定,将菌株命名为粘质沙雷菌(Serratia marcescens SYBC08)。研究还发现该菌株在碳源利用、主要脂肪酸含量等生理生化特征和其它的粘质沙雷菌有差异。该菌株CAT比活力较高,是生长于无H_2O_2环境S. marcescens SYBC-01的10.6倍。高的CAT比活力和产芽孢可能是其能够生长在H_2O_2胁迫环境的机制。通过对硫酸铵沉淀得到了粗CAT,进行主要应用酶学性质的研究表明,初步纯化的CAT在高温强碱和低温条件有一定的应用潜力。 研究了S. marcescens SYBC08摇瓶发酵产CAT的最佳条件。以合成NADH主要途径TCA循环的中间产物柠檬酸为碳源发酵产CAT,较其它碳源提高了产量。推测CAT产量的提高与NADH的合成有密切的关系。再经响应面方法对发酵条件进一步优化。优化后的发酵条件:柠檬酸30 g/L、玉米浆33.8 g/L、初始pH 5.91、接种量4 % (v/v)、装液量50 mL/250 mL、转速250 r/min、温度32.8℃、培养36 h。酶产量从1470 U/mL提高到12165 U/mL,提高了7.27倍。 在5 L小型发酵罐下,以摇瓶发酵的最佳培养基为发酵罐条件下的发酵培养基,研究了S. marcescens SYBC08产CAT的分批发酵条件。最佳的培养条件:通气量1.5 vvm、pH 7.0、转速400 r/min、相对溶氧控制在5 %、发酵时间22 h。在此条件下,CAT最高产量为22422 U/mL。进一步添加100 mg/L的烟酸以调控NADH的合成,CAT产量提高了15.1 %,达到26442 U/mL。 分别以葡萄糖和柠檬酸为发酵碳源,研究了S. marcesces SYBC08产CAT过程的生理特征,分析了柠檬酸促进CAT产量的机制。CAT产量提高的过程中,AhpC活力及胞内VC含量提高较明显,MDA含量下降明显。发现两种碳源发酵的CAT产量均与抗氧化指标有显著或极显著的相关性,说明CAT产量的提高与氧化胁迫有关,柠檬酸为发酵碳源较葡萄糖为发酵碳源有更高的CAT产量,是增强了氧化胁迫。 S. marcescens SYBC08的粗酶液经过硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析纯化得到纯的CAT。该过程的纯化倍数为13.8,回收率为22 %。CAT的分子量为230 kDa,由4个分子量为58 kDa同源亚基组成。该酶的比活力(199584 U/mg蛋白)是Halomonas sp. Sk1的3.44倍。该酶在405 nm和280 nm有吸收峰,A405/A280比值为0.42。K_m和V_(max)分别为78 mmol/L和188212 U/mg。1.0 mmol/L的Mg~(2+)和Ca~(2+)对CAT活力有显著的激活作用,Mn~(2+)、EDTA和邻苯二酚对CAT活力有显著的抑制作用。CAT有较宽的pH最佳活力(pH 7.0-9.0)和pH稳定性范围(pH 5.0-11.0)。最适的温度大约为20℃,在0℃依然有78.5 %的活力,这个结果证明其为常温菌产的低温单功能CAT。经LC-MS/MS氨基酸序列分析,该酶与S. proteamaculans 568的CAT氨基酸序列(gi|157371515 )最为匹配。由S. proteamaculans 568 CAT的基因序列设计引物并获得该CAT基因。该酶基因长度为1437 bp,Genbank上的登录号为HM068611。经该基因推导的氨基酸序列与相关的23个CAT比对并构建系统进化树。结果表明,虽然大部分具有重要功能的位点在24个相关的CAT中是相当保守,S. marcescens SYBC08 CAT推导的氨基酸序列残基(M53、S93、H341、H284和F194)在相关CAT中并不完全保守,说明不同CAT之间的催化行为有一定的多样性。该高比活CAT在肠杆菌科中具有最高的相似性,说明一些肠杆菌科微生物中的该类酶在抵御H_2O_2对细胞的伤害中发挥了重要的生理功能。该基因推导的氨基酸序列预测的二级、三级结构表明,二级结构中含的螺旋结构、折叠片状结构、环形及其它结构含量分别为27.8 %、16.7 %和55.4 %,预测的NORS区在343-423。预测的酶亚基三维结构与已知的1e93A(2.00 ?)有85.169 %的相似度。……   
[关键词]:低温过氧化氢酶;菌株筛选;调控NADH;氧化胁迫;LC-MS/MS;基因克隆与序列分析;粘质沙雷氏菌
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:江南大学2011年