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普鲁兰酶的反向合成特性及应用研究

于博

  普鲁兰酶(Pullulanase, EC 3.2.1.41),是α-淀粉酶家族GH13中的一种。它不仅能专一性的水解普鲁兰、淀粉和糖原中的α-1, 6-糖苷键,而且具有较强的反向合成能力。利用普鲁兰酶的这一特性,可以用来合成麦芽低聚糖和分支环糊精。麦芽低聚糖和分支环糊精作为淀粉深加工的新产品,具有广阔的应用前景。基于课题组的相关研究,本论文从商品普鲁兰酶液中分离纯化得到普鲁兰酶,详细研究该酶的反向合成性质,探讨了其与环糊精的相互作用机制,酶法合成了6~2-α-麦芽三糖基-麦芽三糖和6-α-麦芽三糖基-β-环糊精,并确证了其结构。 采用透析、脱盐柱HiTrap Desalting色谱、HiPrep DEAE FF 16/10离子交换色谱和2次HiPrep Sephacryl S-200HR凝胶色谱等分离纯化技术,从商品普鲁兰酶液中分离得到普鲁兰酶。SDS-PAGE电泳分析呈现单一条带,表明该酶已经达到了电泳纯,分子量约为96kDa。经过分离纯化后,普鲁兰酶的比酶活达到240.7U/mg,纯化倍数为5.77倍。 以葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖和环糊精为底物,研究纯化普鲁兰酶的底物特异性,结果表明纯化的普鲁兰酶具有反向合成活力,最小作用底物为麦芽糖,可以将麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖接枝到环糊精上。以麦芽糖为底物,研究纯化普鲁兰酶的反向合成性质。结果表明普鲁兰酶反向合成的最适pH为4.5,反向合成pH的稳定范围4.0-6.0;普鲁兰酶反向合成的最适温度为65℃,在60-70℃范围内,普鲁兰酶反向活力维持在较高的水平;Na~+、K~+、Li~+和Co~(2+)对普鲁兰酶的反向合成活力影响不大,Hg~(2+)、Sn~(2+)、Cu~(2+)、Ag~+和Pb~(2+)对普鲁兰酶反向活力有较强抑制作用,Ca~(2+)、Mn~(2+)对其反向活力有较为明显的激活作用,Ca~(2+)还可以提高其热稳定性。 β-环糊精(β-CD)对普鲁兰酶的反向合成活性和水解活性都有明显的抑制作用。β-CD与普鲁兰酶分子的包合性试验表明,疏水性空腔是环糊精及其衍生物与普鲁兰酶相互作用的内在因素。疏水性空腔与普鲁兰酶的芳香族氨基酸残基形成了复合物,改变了普鲁兰酶本身的活性构象,导致了普鲁兰酶的失活。β-CD对普鲁兰酶活性的抑制具有浓度依赖关系,随着β-CD浓度的增加,普鲁兰酶活性下降明显。普鲁兰酶内源性荧光光谱的变化表明疏水性空腔与芳香族氨基酸残基之间的包合作用是环糊精抑制普鲁兰酶活性的内在驱动力,β-CD与普鲁兰酶分子形成复合物后,普鲁兰酶分子原有的活性构象和微环境发生了改变。通过对普鲁兰酶圆二色谱的分析,得知β-CD改变了普鲁兰酶的二级结构,致使α-螺旋/β-折叠比率降低,酶分子结构变得松散,活性降低或丧失。环糊精空腔的几何尺寸决定了环糊精与普鲁兰酶相互匹配的效率,β-CD对普鲁兰酶活性的抑制最强。环糊精衍生物中,侧链基团的引入增加了相互作用的空间位阻,降低了环糊精疏水性空腔与普鲁兰酶的结合效率。体系的pH与温度影响了普鲁兰酶与环糊精的相互作用,这主要是由于酶自身结构随pH与温度变化而变化,导致了环糊精与普鲁兰酶结合位点的改变。 以普鲁兰为底物,在普鲁兰酶的作用下,制备麦芽三糖浆。反应条件为普鲁兰浓度为5%(w/v)、反应时间8h、普鲁兰酶浓度10U/g普鲁兰、反应pH5.0、温度55°C,得到麦芽三糖浆中,HPLC分析知麦芽三糖占90.35%。以麦芽三糖浆为底物,利用普鲁兰酶反向合成性质,制备6~2-α-麦芽三糖基-麦芽三糖。反向合成的条件:麦芽三糖浆浓度,70%(w/v);反应时间,44h;普鲁兰酶浓度,120U/g麦芽三糖浆;反应pH4.0;温度65°C。经过制备型的HPLC分离纯化得到产品,通过高效液相色谱、电喷雾质谱、傅里叶变换红外光谱以及~1H NMR, ~(13)C NMR和HMBC谱分析,进一步确证了其结构为62-α-麦芽三糖基-麦芽三糖。 以麦芽三糖浆和β-CD为底物,利用普鲁兰酶反向合成性质,制备6-α-麦芽三糖基-β-环糊精。反向合成的条件:麦芽三糖与β-CD摩尔比,12:1;反应时间,56h;普鲁兰酶浓度,200U/g麦芽三糖浆;反应pH4.5;温度65°C。经过制备型的HPLC分离纯化得到产品,通过高效液相色谱、电喷雾质谱、傅里叶变换红外光谱以及~1H NMR, ~(13)C NMR和HMBC谱分析,进一步确证了其结构为单取代-6-O-α-D-麦芽三糖基-β-环糊精。……