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新疆多浪羊和中国美利奴羊MHC-DRB1、DQB1基因SSCP多态性与包虫病抗性研究

杜迎春

  绵羊主要组织相容性复合体(Major histocompitibility complex, MHC)又称为绵羊淋巴细胞表面抗原(Ovine Lymphocyte Antigen, OLA),是由紧密连锁、高度多态的基因位点组成染色体上的一个遗传区域,其中MHC-Ⅱ类分子的DRB和DQB基因所编码的MHC抗原在其免疫系统中发挥重要的作用,与许多动物疾病的抗性、易感性、免疫应答以及生产性能都有密切关系。本试验对新疆多浪羊和中国美利奴羊(新疆军垦型)MHC-DRB1、DQB1基因PCR-SSCP多态性与包虫病抗性进行了关联分析,在此基础上,探讨了中国美利奴羊不同单倍型个体在人工感染细粒棘球绦虫过程中的免疫应答反应,为绵羊抗病育种及免疫遗传研究提供参考依据。 1、本试验利用PCR-SSCP方法,对新疆多浪羊MHC-DRB]、DQB1基因第2外显子进行遗传多态性分析。分析表明多浪羊DRB1和DQB1基因第2外显子均存在丰富的多态性。DRB1基因中出现了50种基因型,由22种等位基因控制。DQB1基因中出现了42种基因型,由17种等位基因控制。 2、检测了包虫病阴性和阳性多浪羊中DRB1基因出现的等位基因,利用T检验进行差异显著性分析,结果表明等位基因B(p<0.01)、A和C(p<0.05)在阴性羊中的频率显著高于阳性羊,认为B、A、C是包虫病的抗性相关等位基因。等位基因G(p<0.01)、M和R(p<0.05)在阳性羊中的频率显著高于阴性羊,认为G、M和R是包虫病的易感性相关等位基因。分析包虫病阴性和阳性羊的基因型频率,发现基因型BB(p<0.05)在阴性羊中的频率显著高于阳性羊,提示BB是包虫病抗性相关基因型。基因型GG(p<0.01)和MM(p<0.05)在阳性羊中的频率显著高于阴性羊,说明GG和MM是包虫病的易感性相关基因型。 3、进行包虫病阴性和阳性多浪羊DQB1基因中等位基因的差异显著性分析,分析表明等位基因H(p<0.05)和L(p<0.01)在阴性羊中的频率显著高于阳性羊,认为H、L是包虫病的抗性相关等位基因。等位基因J和M(p<0.01)在阳性羊中的频率显著高于阴性羊,认为J和M是包虫病的易感性相关等位基因。分析包虫病阴性和阳性羊的基因型,将它们的基因型频率进行差异显著性分析,结果表明基因型LL和DF(p<0.05)与包虫病抗性紧密相关。基因型MM(p<0.01)在阳性羊中的频率显著高于阴性羊,认为MM是包虫病的易感性相关基因型。 4、为了进一步分析多浪羊DRB1、DQB1基因多态性与包虫病之间的关系,筛选出抗包虫病的遗传标记,本研究分析了不同单倍型与包虫病抗性或易感性的相互关系。结果表明:单倍型DRB1-BB/DQB1-DF (P<0.01)和DRB1-JJ/DQB1-DH (P< 0.05)与包虫病抗性相关,而单倍型DRB1-GGIDQB1-MM (P<0.01)和DRB1-MMIDQB1-JJ (P<0.05)与包虫病易感性相关。 5、利用PCR-SSCP方法,分析中国美利奴羊MHC-DRB1、DQB基因第2外显子的多态性。分析显示,DRB1和DQB1基因第2外显子亦存在丰富的多态性。DRB1基因中出现了53种基因型,由22种等位基因控制。DQB1基因中出现了47种基因型,由17种等位基因控制。 6、利用T检验进行包虫病阴性和阳性中国美利奴羊DRB1基因的等位基因差异显著性分析,结果表明等位基因K(p<0.05)、Q和T(p<0.01)在阴性羊中的频率显著高于阳性羊,表明K、Q、T与包虫病的抗性相关,等位基因A和L(p<0.01)在阳性羊中的频率显著高于阴性羊,认为与包虫病的易感性相关。分析包虫病阴性和阳性中国美利奴羊的基因型,发现基因型KK和TT(p<0.05)在阴性羊中的频率显著高于阳性羊,表明KK和TT是包虫病抗性相关基因型。同样分析表明,基因型AA和LL(p<0.01)、AL(p<0.05)是包虫病的易感性相关基因型。 7、分析包虫病阴性和阳性中国美利奴羊DQB1基因出现的等位基因的差异,发现等位基因D和E(P<0.01)在阴性羊的频率显著高于阳性羊,说明D、E与包虫病的抗性相关。同样,结果表明等位基因C和K(p<0.01)与包虫病的易感性相关。分析包虫病阴性和阳性中国美利奴羊的基因型,发现基因型DD和EG(p<0.01)、EE(p<0.05)在阴性羊中的频率显著高于阳性羊,认为DD、EG和EE是包虫病抗性相关基因型。同样分析表明,基因型CC、KK和CK(p<0.01)是包虫病的易感性相关基因型。 8、为了更全面地分析中国美利奴羊DRB1、DQB基因多态性与包虫病之间的关系,分析了中国美利奴羊不同单倍型与包虫病抗性或易感性的相关性。结果表明单倍型DRB-TT/DQB-EE (P<0.05)是包虫病抗性相关单倍型,而单倍型DRB1-LL/DQB1-CK和DRB1-AA/DQB1-C1与包虫病易感性相关。 9、在DRB1和DQB1基因多态性分析的基础上,筛选中国美利奴羊抗性单倍型DRB1-TT/DQB1-EE个体作为抗性组,非抗性单倍型个体作为对照组进行人工感染攻虫试验,分析不同的单倍型个体感染包虫病过程中的免疫应答反应。在攻虫前7天(-7d)、攻虫当天(0d)、攻虫后第7d、21d、30d、60d用流式细胞仪分析外周血中CD4+T、CD8+T、B淋巴细胞亚群的变化,同时用ELISA方法定量分析不同感染时期血清中IgG、IgM、IgE、IFN-y含量,并利用瑞式染色法进行粒细胞计数。结果表明,CD4+T和B淋巴细胞两组之间差异不显著(P>0.05),CD8+T细胞在攻虫后第7d抗性组显著高于对照组(P<0.05):IgG水平在攻虫后第7d两组均显著高于攻虫前7d(P<0.05)。攻虫后第30d抗性组IgM和IFN-y水平均显著高于对照组(P<0.05)。抗性组的白细胞、淋巴细胞分别在攻虫后第7d、21d显著高于对照组(P<0.05),嗜中性粒细胞和总蛋白在攻虫后第21d抗性组显著低于对照组(P<0.01)。结论,抗性单倍型绵羊对E.g的抵抗力显著高于非抗性单倍型绵羊;抗性组绵羊体内的CD8+T细胞、IgM、IFN-y和白细胞、淋巴细胞水平在攻虫后不同时期显著高于非抗性组绵羊。 10、抗性羊DRB1基因表达量在攻虫后第60d显著高于攻虫Od(P<0.05)和攻虫后第30d(P<0.05);非抗性羊DRB1基因表达量在攻虫后第21d显著高于攻虫0d(P<0.01)和攻虫后第7d(P<0.05),攻虫后第30d极显著低于攻虫后第21d(P<0.01)。抗性羊在攻虫后第21d(p<0.01)、60d(P<0.05)DQB1表达量显著高于攻虫0d,第30d时DQB1表达量显著低于攻虫后第21d(P<0.05);对照组DQB1表达量同抗性组的变化趋势基本一致,在攻虫后第21d的表达量显著高于攻虫0d(P<0.05),在攻虫后第30d显著低于攻虫后第21d(p<0.05)。抗性羊与非抗性羊之间两种基因的表达无显著差异。……   
[关键词]:多浪羊;中国美利奴羊;包虫病;PCR-SSCP;MHC
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:石河子大学2010年