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PPARγ在大豆异黄酮抑制叔丁基过氧化氢诱导人血管内皮细胞氧化应激损伤中的作用研究

王凡

  心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)是一系列涉及循环系统的疾病,其发病率占全球总发病率的三分之一以上,更是发达国家最为主要的死亡原因,在发展中国家的死亡率也逐年递增。心血管疾病的发生常常与动脉硬化有关。 动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是一类严重威胁人类健康和生命的疾病。随着我国人民生活水平提高和饮食习惯改变,该病也成为我国的一个主要死亡原因。AS的发病机制复杂,一般认为该病是多种因素长期共同作用的结果,其中氧化应激是AS斑块形成学说中的重要组成部分,活性氧族(reactive oxygen species, ROS)大量生成导致的内皮细胞(endothelial cells, ECs)功能性损伤是AS发生的始动环节。 大豆异黄酮(soy isoflavone,SI)是天然存在于豆科植物中,在豆类生长中形成的一类次级代谢产物,属于黄酮类化合物的一种,因与雌激素有相似的结构,而被称为植物雌激素。SI具有广泛的生物学效应,如抗肿瘤、防治骨质疏松、改善更年期症状、治疗心血管疾病等多方面效应,体内实验表明其具有抗动脉粥样硬化效应。染料木黄酮(Genistein, Gen)是SI在人体内的主要存在形式,也是研究最多的SI,大量有关SI的体内外实验都是围绕Gen展开的。流行病学证据显示有摄食大豆制品传统的亚洲国家特别是中国和日本CVD发病率远低于欧美国家,进一步研究发现亚洲人血清中的Gen可达300 nmol/L,远远高于没有食用豆制品习惯的欧美人血清中Gen的水平(6 nmol/L)。但是,有关Gen抗AS的分子机制尚不清楚。过氧化酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators-activated receptor gamma, PPARγ)是核受体超家族中的一员。近期研究发现PPARγ活化后可改善内皮功能。由此,我们推测,Gen是通过活化PPARγ来保护内皮细胞并进一步达到抗AS的效果。 基于上述分析,结合国内外研究进展,本研究以人血管内皮细胞株EA.hy926为研究对象,首先建立以叔丁基过氧化氢(tert-butyl hydroperoxide,t-BHP)诱导的氧化应激损伤体外模型,然后以Gen和t-BHP对EA.hy926内皮细胞株进行单独和联合处理,通过CCK-8、荧光染色法(fluorescent staining)和流式细胞仪观察Gen对内皮细胞的活性及凋亡的影响,并运用蛋白免疫印迹(Western blot,WB)检测Caspase-3的表达变化;另外以Gen对EA.hy926内皮细胞株进行处理,运用蛋白免疫印迹、免疫细胞化学(immunohistochemistry,IHC)以及Real-time PCR等实验方法,观察Gen对EA.hy926中PPARγ蛋白表达以及核转位的影响,并运用CCK-8法检测抑制剂GW9662对PPARγ保护内皮细胞凋亡的影响,旨在揭示PPARγ在大豆异黄酮抑制氧化应激诱导人血管内皮细胞损伤中的作用。 主要研究结果和结论如下: 1.利用t-BHP建立人脐静脉内皮细胞株EA.hy926的体外氧化应激损伤模型。按梯度向接种的细胞中加入不同浓度的t-BHP,CCK-8法检测发现,t-BHP能明显抑制EA.hy926的生长,至最大浓度240μmol/L时,抑制率达到(93.66±4.66)%,半数抑制浓度(IC50)为100μmol/L;激光共聚焦显微镜观察发现在EA.hy926的细胞核区域出现明显的凋亡小体; 2.按梯度向接种的细胞中加入不同浓度的Gen,CCK-8法测定后发现Gen能显著抑制t-BHP诱导的内皮细胞凋亡,并呈明显的剂量-效应关系,500 nmol/L时,预处理组的细胞保护率为33.11%,流式细胞仪检测亦发现此时总凋亡率为12.20%,与对照组相比,P<0.05;Western blot检测结果表明Gen能明显抑制Caspase-3的表达,且在500 nmol/L时抑制程度达到最高; 3.预制细胞爬片,加入500 nmol/L的Gen预处理10 h,进行免疫细胞化学检测,与对照组相比,EA.hy926的PPARγ表达向细胞核内转移;提取细胞总蛋白、细胞核蛋白以及细胞浆蛋白,通过Western blot检测,发现在1~16 h内,总蛋白中PPARγ的表达水平随着Gen处理时间延长逐渐增加,至4 h达到最高,尤其表现在细胞核蛋白的检测中,而在细胞浆蛋白的检测中,PPARγ的表达量并无明显的水平差异;通过PCR检测,经过Gen处理,PPARγ在转录水平的表达也明显增高; 4.向接种的细胞中加入PPARγ的抑制剂GW9662处理24 h,经过CCK-8法检测,发现细胞活力明显低于Gen预处理组,GW9662有效的削弱了Gen对t-BHP诱导的细胞损伤的保护作用。 综合上述实验结果,得出全文结论,染料木黄酮可以显著抑制叔丁基过氧化氢造成的细胞凋亡,并最终达到对t-BHP诱导的内皮细胞凋亡有保护效应,这一保护效应可能是通过促进PPARγ的活化而实现的。……   
[关键词]:染料木黄酮;内皮细胞;叔丁基过氧化氢;PPARγ
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:第三军医大学2011年