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人乳头瘤病毒16型E5与IL-12联合基因疫苗的免疫效果研究

李薇

  目的: 构建人乳头瘤病毒16型(HPV16)E5蛋白真核与原核表达载体,分析E5与IL-12联合基因疫苗接种BALB/c小鼠后的免疫活性,为HPV防治性疫苗的研制奠定前期试验基础。 方法: (1)运用PRIMER5.0软件设计HPV16 E5基因特异性引物,PCR扩增E5基因,经BamHI、EcoRI或NotI双酶切后将其分别连接入pcDNA3.1(+)或pGEX-6P-1相应酶切位点;PCR及酶切鉴定插入片段,筛选阳性克隆进行DNA序列分析,构建真核表达载体pcDNA3.1(+)/E5与原核表达载体pGEX-6P-1/E5。 (2)将质粒pGEX-6P-1/E5转化E.coli BL21,用IPTG进行诱导表达,纯化表达产物,Western- blot检测GST-HPV16 E5纯化产物。将质粒pcDNA3.1(+)/E5转染HeLa细胞,利用RT-PCR测定HPV16 E5 mRNA表达。 (3)将50只BALB/c小鼠随机分为pcDNA3.1(+)/E5组、pcDNA3.1(+)/E5+ pcDNA 3.1(+)/IL-12组、pcDNA3.1(+)/IL-12组、pcDNA3.1(+)组和PBS空白组,每组10只。将100μg质粒或100μL PBS分别通过肌肉接种小鼠,隔2周接种1次,共接种4次。每次免疫前一天收集血清。末次免疫后第14天收集小鼠血清后,取小鼠脾脏制备脾细胞悬液并培养;另取小鼠股四头肌制成石蜡切片。 (4) ELISA间接法测定小鼠血清中抗HPV16 E5特异性IgG水平,ELISA双抗体夹心法检测小鼠脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ和IL-4含量,MTT比色法检测脾淋巴细胞增殖反应,免疫组织化学法检测E5蛋白在小鼠肌肉组织中的表达情况。 结果: (1) DNA测序结果显示PCR扩增得到252bp HPV16 E5基因片段,并分别连接入pcDNA3.1(+)与pGEX-6P-1载体。构建的pcDNA3.1(+)/E5真核表达载体在HeLa细胞表达了HPV16 E5 mRNA。 (2)构建的pGEX-6P-1/E5原核表达载体在E.coli BL21中表达分子量约35kDa GST-HPV16 E5融合蛋白;Western-blot检测该重组蛋白能与抗HPV16 E5抗体结合,表达的融合蛋白分子量约35kDa。 (3)联合基因疫苗组[pcDNA3.1(+)/E5+pcDNA3.1(+)/IL-12]和单基因疫苗组[pcDNA3.1(+)/E5]血清IgG抗体水平随免疫时间的延长呈上升趋势;最后一次免疫的血清IgG A450值分别为(0.771±0.051)和(0.330±0.078),明显高于pcDNA3.1(+)组(0.080±0.035)、pcDNA3.1(+)/IL-12组(0.110±0.015)和PBS组(0.078±0.020) (P<0.01);且联合基因疫苗组显著高于单基因疫苗组(P<0.01)。 (4)联合基因疫苗组和单基因疫苗组脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-4含量最高,分别为(352.89±36.76 pg/ml、680.23±36.04 pg/ml)和(206.53±15.40 pg/ml、359.94±48.23pg/ml) ,均明显高于pcDNA3.1(+)组(18.04±2.24 pg /ml、40.41±4.11pg/ml)、pcDNA3.1(+)/IL-12组(42.15±4.89pg/ml、177.59±24.33pg/ml)、pcDNA3.1(+)组(18.04±2.24pg/ml、40.41±4.11pg/ml)、PBS组(14.98±2.03 pg/ml、25.73±2.02 pg/ml) (P<0.01 );且联合基因疫苗组显著高于单基因疫苗组(P<0.01)。联合基因疫苗组和单基因疫苗组脾淋巴细胞刺激指数(SI)分别为(2.14±0.27)和(1.85±0.11),显著高于pcDNA3.1(+)组(1.19±0.07)、pcDNA3.1(+)/IL-12组(1.24±0.12)和PBS组(1.13±0.15) (P<0.01);联合基因疫苗组与单基因疫苗组比较,SI差异无统计学意义(P>0.05)。小鼠股四头肌组织中有HPV16 E5蛋白的表达。 结论: (1)构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)/E5能在真核细胞中表达HPV16 E5。 (2)构建的原核表达载体pGEX-6P-1/E5能在E.coli表达融合蛋白GST-HPV16 E5,并具有良好的抗原性。 (3) HPV16 E5单基因疫苗以及与IL-12联合基因疫苗均能刺激机体产生较强的细胞免疫和体液免疫应答,且联合基因疫苗优于单基因疫苗。……   
[关键词]:人乳头瘤病毒16型(HPV16);E5;IL-12;疫苗
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:南华大学2011年