手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

固定化酶膜反应器藕合错流萃取色谱制备5’-核苷酸

华杰

  本文针对5 -磷酸二酯酶水解酵母RNA制备5 -核苷酸工艺中存在的技术问题,开展了对酶制剂制备技术及RNA酶解工艺的改进研究。改进了酶活性的测定方法,研究了从麦芽根中浸取和提纯5 -磷酸二酯酶的技术以及RNA酶解反应动力学,探索了麦芽根5 -磷酸二酯酶的固定化方法,进一步研究了该固定化酶在膜反应器中水解酵母RNA的工艺,并设计了一种新的连续错流萃取色谱分离系统,用于复杂酶解产物的分离。研究工作和主要结果如下: 改进了传统的测定5 -磷酸二酯酶酶活的UV-RNA法,提出了HPLC-RNA酶活测定法。该方法的特点是:1)能测定混合酶中5 -磷酸二酯酶的酶活;2)精密度高,性线范围大。当麦芽根的蛋白质浓度在0.02~1.20 mg/mL范围内时,蛋白质浓度与5 -核苷酸产量的线性相关系数R=0.9997,相对标准偏差(R.S.D)为5.7%。 采用正交实验法优化了从麦芽根中提取5 -磷酸二酯酶的操作条件。最佳条件为:麦芽根粒径120目,浸取液pH=7,浸取温度10℃,麦芽根:水=1:16(质量比),浸取时间5 h。在该条件下,每克麦芽根提取的总酶活为4470 U,5 -磷酸二酯酶的单位酶活为280 U/mL。 采用硫酸铵沉淀、超滤浓缩、透析膜脱盐,以及Sephadex G-25、Sephadex G-75凝胶层析提纯,获得了比酶活为0.02137 mmol/ (mgxmin)的5 -磷酸二酯酶制剂,比未经硫酸铵沉淀的粗酶液的比酶活提高了6倍。 探讨了5 -磷酸二酯酶催化水解RNA的反应机理,研究了酶的主要酶学特征值。实验测得米氏常数Km=8.73 mg/mL(底物为RNA),最大反应速度Vmax=14.27×10-3 mg/(mL·min),酶的最适pH值为5.0,最适温度为70℃。考察了酶的稳定性,发现5 -磷酸二酯酶在pH值为5-7的范围内比较稳定,短时间置于较高的温度(50-70℃)下,能保持较高的酶活。在酶液中加入金属离子一股都会导致酶活下降,但镁离子有促进酶活的效应,体现了与桔青霉5 -磷酸二酯酶不同的特性。5 -核苷酸是麦芽根5 -磷酸二酯酶的抑制剂,不断移除RNA酶解反应产物中的5 -核苷酸,有利于酶解反应的进行。 采用戊二醛活化的壳聚糖为载体,固定了麦芽根5 -磷酸二酯酶。试验结果表明,当酶固定化温度为30℃、固定化酶pH值为5.0、固定化时间为6h的最适条件下,最高的酶活回收率可达53.6%。所制得的固定化酶的最适温度为75℃,最适pH值为5.5。研究表明,固定化酶比游离酶更纯,酶的固定化过程也起到了提纯酶的作用。研究了固定化5 -磷酸二酯酶的酶学性质,测得固定化酶的米氏常数Km为15.38 mg/mL(底物为RNA) 设计装配了一种管式固定床反应器(CPFR)与中空纤维超滤膜相耦合的反应-分离装置。考察了反应温度、pH值、底物浓度等因素对反应进程的影响。酶解反应的最适操作条件为:反应温度为75℃,pH值为5.5,RNA浓度控制在3%以内。在反应-分离耦合装置上进行了较长时间连续酶解RNA的操作,核苷酸的总收率达到了88.3%。反应结束后,固定化5 -磷酸二酯酶能保持原酶74.6%的活性,表明固定化酶具有良好的稳定性。 发明了一种连续错流萃取色谱分离系统,推导出了该系统重相出口和轻相出口中的流出色谱图的数学表达式(流出曲线),从理论上证明该系统能够连续、大处理量、高选择性地分离多组分复杂混合物。采用6×6的错流萃取色谱分离系统分离了5 -AMP和苯甲酸的混合物,实验结果与理论计算值相当吻合,证明该系统能实现混合物的高分辨分离。……   
[关键词]:5'-磷酸二酯酶;5'-核苷酸;麦芽根;酶膜反应器;连续错流萃取色谱
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中南大学2011年
App内打开