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内皮抑素在肺腺癌中的表达及其对小鼠Lewis肺癌淋巴管生成和淋巴转移的影响

董晓鹏

  研究背景和目的 肺癌是一个世界范围内的严重危害人们健康的恶性肿瘤,已居各类恶性肿瘤死亡率首位。特别是肺腺癌,早期症状不明显,缺少有效的早期、无创检查方法,并且具有高侵袭性、高转移性的生物学特性,早期即可发生血液和淋巴转移,因而研究肺腺癌的血管和淋巴管生成及转移的相关分子机制,寻找阻断其血液和淋巴转移的新方法,具有非常重要的意义。 传统的治疗包括手术、化疗和放疗等均不能很好的组织肿瘤的转移,随着对肿瘤认识的逐渐深入,现已知道实体肿瘤的发生、生长、浸润以及转移均依赖于新生血管的形成,因此抗血管生成治疗如血管抑素、内皮抑素等的发现和应用为肿瘤治疗开辟了一条新的道路。然而,淋巴管系统与血管系统是一个互为交通的网络结构,肿瘤细胞可在两个管道系统之间自由进出,单纯阻断血管途径并不能很好地控制肿瘤细胞远处转移,而且肿瘤血管生成的过程也需要淋巴管参与,因此近年来关于肿瘤淋巴管生成的研究越来越得到重视。 内皮抑素是0 Reilly等首先从培养的鼠内皮细胞瘤上清液中发现的血管生成抑制因子,它能特异性抑制血管内皮细胞增殖并明显地抑制肿瘤的生长和转移。体外实验证实,endostatin对淋巴管内皮细胞增殖亦具有明显的抑制作用,而且呈剂量依赖性,而endostatin是否具有抑制肿瘤淋巴管生成进而抑制肿瘤淋巴转移的作用,目前关于此方面的研究国内外均少见。endostar是在endostatin上添加了9个氨基酸的新型重组endostatin,稳定性高、纯度高,为研究endostatin抗淋巴管生成的研究提供了简便易行的途径。 本课题首先检测了人肺腺癌endostatin表达和微淋巴管密度(MLVD),研究endostatin在肺腺癌中的表达及其与淋巴管生成和淋巴转移的相关性;然后建立Lewis肺癌小鼠模型,对重组内皮抑素endostar对Lewis肺癌生长及淋巴管生成的影响进行了研究,以期为今后endostatin应用于肺癌的抗淋巴转移治疗提供一定的理论依据。 材料和方法 第一部分人肺腺癌内皮抑素表达与微淋巴管密度及淋巴转移的关系 60例肺癌组织标本取自山东大学第二医院胸外科自2006年3月-2009年5月接受手术治疗的病人,所有病人术前均未接受过放疗或化疗等治疗,术后病理均证实为肺腺癌。其中:男33例,女27例;年龄45-69岁。60例标本中,低分化腺癌29例,高中分化腺癌31例;中心型肺癌32例,周围型肺癌28例。根据UICC1997年肺癌P-TNM分期标准,Ⅰ期+Ⅱ期25例,Ⅲ期+Ⅳ期35例。采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶连接(Streptavidin-peroxidase, S-P)免疫组织化学方法检测肺癌组织endostatin蛋白的表达及肺癌组织微淋巴管密度(Micro lymphatic vessel density, MLVD),一抗endostatin单抗购自美国Santa Cruz公司,D2-40抗体购自英国Abeam公司,S-P试剂盒购自北京中山公司。实验步骤严格按照试剂盒说明书进行。将已知阳性胃癌切片作为阳性对照,用PBS代替一抗作为阴性对照。endostatin根据细胞染色强度和染色细胞所占面积积分之和来判断。染色强度积分:不染色为0分,浅黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分;染色面积:无细胞染色为0分,<25%细胞染色为1分,25%-50%细胞染色为2分,>50%细胞染色为3分;两者积分之和>2,则为表达阳性,≤2则为表达阴性。D2-40阳性染色的内皮细胞计为淋巴管,先在低倍镜(100倍)下寻找阳性脉管密集区,然后换高倍镜(400倍)选取5个视野计数,取其平均值作为每例的MLVD。 第二部分重组内皮抑素对小鼠Lewis肺癌淋巴管生成和淋巴转移的影响 复苏Lewis肺癌瘤种,种植于C57BL/6小鼠右腋下,传至第3代,将瘤细胞取出,研磨,筛网过滤,调细胞浓度为5×106/L,进行尾静脉注射,每只小鼠注射约1×106个细胞。肿瘤接种8天后,随机将小鼠分为两组,每组20只。对照组接受生理盐水皮下注射,0.2ml/(天·只);实验组接受重组内皮抑素endostar皮下注射,500μg/(天·只);连续注射15天。接种瘤细胞后开始观察,观察期为6周。观察期结束后处死小鼠,剖胸取出肺脏,并收集淋巴结(包括颈上淋巴结群、臂部淋巴结群、椎旁淋巴结群、颈深淋巴结群、纵隔淋巴结群)。放大镜下计数肺表面长径大于2mm的肿瘤数,并用游标卡尺测量每个肿瘤长径,平均肿瘤长径=肿瘤长径之和/肿瘤数。肺肿瘤标本固定、脱水并包埋。切片分别做D2-40和VEGF-C的免疫组化染色。 RT-PCR法检测VEGF-C mRNA在小鼠肺腺癌新鲜组织中的表达。按照Trizol的说明书,先用Trizol一步法提取小鼠肺癌组织中的总RNA,然后用紫外分光光度计测定纯度并定量。引物序列:VEGF-C 5-AAGACCGTGTGCGAATCGA -3 5 - ACACAGCGGCATACTTCTTCAC -3 β-actin 5 -CACTATTGGCAACGAGCGG-3 5 -TCCATACCCAAGAAGGAAGGC -3采用贝西生物技术有限公司RT-PCR试剂盒。取总RNA1μg,加入DEPC处理的0.5ml Eppendorf管中,组成20μl逆转录反应体系中,于37℃,1h,95℃10分钟灭活MMLV,终止逆转录。按如下条件组成PCR反应体系,摸板cDNA 2.5μl 5×PCR Buffer 2.5μl灭菌蒸馏水7.2μl聚合酶E×TaqHS 0.1μ上游引物0.1μl下游引物0.1μlTotal 12.5μl混匀快速离心一次反应条件94℃2min 94℃40sec 50-65℃40sec| 35Cycles 72℃1 min 72℃7min 1 Cycle 1.5%琼脂糖电泳鉴定。半定量分析:用凝胶成像分析系统测出VEGF-C和β-actin mRNA的表达强度,或计算相对系数。相对系数=特异性基因表达强度/β-actin表达强度。 结果 1,肺腺癌内皮抑素表达与微淋巴管密度及淋巴转移的关系 肺腺癌组织中endostatin阳性染色位于细胞浆和细胞核,以细胞浆表达为主,肿瘤间质细胞也可见阳性染色。Endostatin在60例肺腺癌组织中23例表达为阴性,37例阳性表达,阳性率为61.7%。D2-40阳性脉管呈管腔状、条索状,弥漫或散在分布在癌巢周围间质,常可见癌细胞浸润。Endostatin阳性组MLVD为7.68±1.89,阴性组为9.17±1.95,差异有统计学意义(P<0.01)。单因素方差分析显示,MLVD在不同程度endostatin表达的病例中,随着endostatin表达积分的增高,MLVD减少。Endostatin表达与肿瘤分期有关,Ⅰ-Ⅱ期endostatin阳性表达率显著高于Ⅲ-Ⅳ期(P=0.014);endostatin阳性组淋巴结转移较阴性组减少(P=0.013)。Endostatin的表达与肿瘤大小、细胞分化程度相关(P<0.05),与患者性别、年龄和位置无明显相关性。 2,重组内皮抑素对小鼠Lewis肺癌淋巴管生成和淋巴转移的影响 对照组及实验组小鼠肺癌发生率均为90%(18/20),两组分别有两只小鼠未见肺肿瘤发生,不计入统计。对照组小鼠肺表面肿瘤数为5.61±1.24,实验组为4.67±1.14,差异有显著性意义(P=0.023);对照组肿瘤平均长径为4.033±0.526,实验组为3.461±0.658,差异有显著性意义(P=0.007)。对照组和实验组小鼠分别发现有8例和2例有淋巴结转移,两组差异有统计学意义(P=0.026)。对照组小鼠肺癌组织微淋巴管密度为7.78±1.56,实验组为5.67±1.57;差异有显著性意义(P<0.01)。免疫组化显示对照组小鼠中VEGF-C阳性率为66.7%(12/18),实验组为27.8%(5/18),对照组VEGF-C表达阳性率高于实验组(P=0.019)。对照组和实验组肺癌组织中VEGF-C mRNA都有不同程度的表达,对照组癌中高表达(0.644±0.109),实验组中低表达(0.334±0.104) (P<0.01)。 结论 1, Endostatin在肺腺癌中的表达与微淋巴管密度和淋巴结转移相关。 2, Endostatin表达与肺癌肿瘤大小、细胞分化程度及病理分期相关,与性别、年龄和肿瘤位置无相关性。 3,重组内皮抑素对小鼠Lewis肺癌生长、淋巴管生成和淋巴结转移均具有抑制作用。 4,重组内皮抑素可下调肺癌VEGF-C基因表达,并进而影响肿瘤生长和淋巴管生成。……   
[关键词]:内皮抑素;肺肿瘤;淋巴管生成;淋巴转移;血管内皮生长因子C
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:山东大学2011年