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海南省菠萝主要病原真菌鉴定及病原病毒多重RT-PCR检测体系的建立

罗志文

  菠萝Ananas comosus (L.) Merr.,属凤梨科(Bromeliaceae)凤梨属(Ananas)多年生单子叶常绿草本果树植物,在我国主要分布于广东、海南、广西、台湾、福建、云南等省(区),在海南菠萝更是著名的三大热带水果之一。在众多影响菠萝产业健康发展的因素中,病害因子一直以来都是影响海南菠萝生长生产的最重要因素,但由于缺乏系统性的调查研究,目前各界对海南省菠萝病害的了解还不甚深入和全面。本研究针对该问题,对海南省菠萝主产区真菌及病毒病害进行了较为系统、细致的调查研究,取得以下主要结果:1.调查显示海南省菠萝主要病害有9种,其中以凋萎病(Pineapple Mealybug Wilt,PMW)、炭疽病(Colletotrichum gloeosporioides Penz.)、烂果病(Alternaria alternata (Fr.)Keissler)及心腐病(Phytophthora parasitica Dast.)的危害最为普遍和严重,而灰斑病(Exserohilum rostratum (Drech) Leo.&Sug.)和轮斑病(Chaetomium aureum Chivers)为食用菠萝上首次发现、报道。 2.病原菌生物学特性研究表明:炭疽病病原菌(C. gloeosporioides)菌丝生长及孢子萌发最适温度分别为28℃和28~30℃;病原菌生长和孢子萌发最适pH值为7和6;麦芽糖为菌丝生长的最适宜碳源,葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖均为病原孢子萌发的适宜碳源;病原在含酵母浸粉的Czapek培养基上生长最好,酵母浸粉、天冬氨酸、牛肉浸膏和蛋白胨有利于孢子萌发;完全黑暗最利于菌丝生长,分生孢子在完全光照和光/暗交替条件下的萌发率较高;病原孢子水滴条件下的孢子萌发率最高;病菌致死温度为55℃处理10min。 烂果病病原菌(A. alternata)菌丝生长和孢子萌发最适生长温度分别均为28℃;菌丝生长和孢子萌发最适pH值为9和8;麦芽糖为菌丝生长的最适宜碳源,蔗糖、半乳糖、果糖和木糖为病原分生孢子萌发的适宜碳源;病原生长的最适宜氮源为硝酸铵,酵母浸粉和天冬氨酸有利于孢子萌发;完全光照最利于菌丝生长,分生孢子在光/暗交替条件下萌发率最高;病原孢子在RH≥95%的条件下才能萌发,水滴条件下孢子萌发率最高;病菌致死温度为55℃处理20min。 灰斑病病原菌(E. rostratum)最适生长和萌发最适温度分别为28℃和30℃;病原生长和萌发最适pH分别为8和7~8;半乳糖、蔗糖和麦芽糖为菌丝生长的最适宜碳源,木糖、蔗糖和麦芽糖较有利于孢子萌发;病原在含酵母浸粉、蛋白胨和硝酸铵的Czapek培养基上生长最好,酵母浸粉、牛肉浸膏和蛋白胨有利于孢子萌发;光暗交替最利于菌丝生长和孢子萌发;RH≥90%时,病原孢子开始萌发,水滴条件下病原孢子的萌发率最高(72.50-96.33%);病菌致死温度为55℃处理15min。 3.部分病原rDNA-ITS序列分析结果表明:2株烂果病病原菌和2株灰斑病病原菌的ITS序列分别为569bp和602bp,经比对与同源性分析,获得的序列确为交链链格孢菌(A. alternata)和喙状凸脐孢菌(E. rostratum)的ITS序列,与形态学鉴定的结果相符,利用真菌rDNA-ITS序列分析对不能通过形态学特征直接鉴定出来的病原菌进行辅助鉴定、分类是可行、有用和可靠的。 4.凋萎病疑似病株病原RT-PCR检测结果表明:所扩增到的4个目的片段大小分别为520、542、473和730bp,同源性比对后发现此4个片段分别属PMWaV-1 HSP70h、PMWaV-2 HSP70h、PMWaV-3 HSP70h和PBCoV Polyprotein基因的部分序列,故初步确认海南省菠萝凋萎病疑似样本中至少存在PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3和PBCoV共4种病毒的复合侵染。 5.病毒病原多重RT-PCR检测试验结果表明:海南省菠萝三种病毒PMWaV-1、PMWaV-2及PBCoV多重RT-PCR体系的最优因子分别为(25μL体系):退火温度(Tm)53℃, dNTPs浓度100-200μM, Taq酶浓度0.5-1.0U,延伸时间60-90s,循环次数30~35次,此条件下可以同时、快速、有效地检测到凋萎病植株中的三种病毒。灵敏度试验结果显示,本体系对PMWaV-2的检测灵敏度最高,PBCoV其次,PMWaV-1最低,换算结果表明能从最少相当于10-2、10-5和10-3μg的样品中分别检测到PMWaV-1 PMWaV-2和PBCoV三种病毒,而若要同时检测到这三种病毒,则最少需要相当于10-2μg的样品量或组织量。……   
[关键词]:菠萝;真菌病原鉴定;病毒病原鉴定;生物学特性研究;rDNA-ITS扩增;RT-PCR检测;多重RT-PCR体系
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:海南大学2011年