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籽粒苋AmA1基因和人乳铁蛋白基因转化水稻的研究

许明

  水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的粮食作物之一,稻米营养品质的优劣对人类健康和水稻生产具有重要的影响,其中蛋白质、必需氨基酸和微量元素是人们主要关注的稻米营养特性。稻米蛋白质中的赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和色氨酸等人体必需氨基酸含量偏低,以致其蛋白质利用率低,营养不够完全。所以,提高稻米蛋白质中的必需氨基酸含量,显得十分必要。AmA1是一种分离于籽粒苋(Amaranthus L.)种子的人体必需氨基酸平衡蛋白质,该蛋白中的8种人体必需氨基酸含量均超过FAO/WHO推荐的理想蛋白质标准,且对人体不会造成过敏,在改良作物种子蛋白质营养上具有重要的应用前景。人乳铁蛋白(human lactoferrin,hLF)具有多种生物学功能,不仅可以提高铁营养,还具有广谱抗病菌、调节机体免疫反应等功能,该生物学功能若能为水稻所利用,将大大增加稻米内铁的生物有效性。 受到种质资源及种间生殖隔离等因素的限制,利用常规育种手段改善稻米的营养品质,存在一定困难。本研究通过转基因技术将必需氨基酸平衡蛋白基因AmA1和人乳铁蛋白基因hLF转入水稻,使其在水稻种子中特异性高效表达,以达到改进稻米必需氨基酸组成和提高铁营养的目的。主要研究结果如下: 1、为了使异源蛋白基因AmA1和hLF在转基因水稻种子中特异性高效表达并积累。本研究首先根据已报道的水稻种子特异性启动子核苷酸序列,从水稻中克隆了2个谷蛋白基因(GluB-1、Gt1)启动子和1个油膜蛋白基因Ole18启动子序列,并将这3个启动子以及组成型启动子CaMV 35S,分别与报告基因GUS相连再导入同一水稻品种中,以确定这些启动子的表达强弱及特异性。序列分析和转基因水稻的GUS活性分析结果表明:(1)从水稻“日本晴”克隆中的Gt1和ole18启动子与已报道序列完全一致,从水稻“台粳9号”中克隆的GluB-1启动子序列与已报道序列存在部分碱基差异,二者同源性为97%。启动子预测软件NNPP、顺式组件分析以及转基因水稻实验证实,该启动子能引导GUS基因在水稻胚乳中特异性表达,碱基差异没有对其功能造成影响。(2)Gt1和GluB-1基因启动子调控GUS基因在水稻胚乳中表达的活性强弱差异不大,但都明显高于CaMV35S启动子;Gt1启动子和Ole18启动子都具有严格的组织表达特异性,其中Gt1启动子引导GUS基因仅在水稻胚乳中特异性表达,Ole18启动子则能引导GUS基因仅在水稻胚和种皮中表达。 2、根据已知的籽粒苋AmA1基因序列,从籽粒苋“千穗谷NO1”种子中克隆了AmA1基因的开放阅读框序列。序列分析表明,所克隆的AmA1基因的开放阅读框序列与已报道序列基本一致,仅存在1个碱基差异,但未改变氨基酸的编码。应用分子伴侣载体pBB540、pBB542和原核表达载体pET28a(+)进行了AmA1基因的原核表达及融合蛋白纯化。结果表明,经过IPTG的诱导,AmA1基因在宿主大肠杆菌中能正确表达出与预期大小一致(37kD)的融合蛋白,借助分子伴侣载体可以显著提高AmA1融合蛋白的可溶性。 3、对已报道的植物基因组DNA快速提取方法作了进一步简化和改进,建立了一种适于大规模转基因水稻PCR检测的微量DNA提取法。通过DNA提取质量和PCR扩增效果比较发现,用该方法提取的水稻基因组DNA完整性较好,PCR扩增效果优于碱裂解法,与试剂盒提取法无明显的差异,结果稳定可靠;而且整个提取过程操作简单,花费时间少,平均一个样品只需5~6min;起始植物材料用量少,仅需5~10mg。 4、构建了Gt1和Ole18基因启动子分别驱动AmA1基因表达的双T-DNA、双MARs植物表达载体PCDMAR-pGt1-AmA1-hpt和PCDMAR-pOle18-AmA1-hpt,并采用农杆菌介导法,将它们转入水稻明恢86和台粳9号中。PCR和Southern blot检测表明,以上两种载体携带的AmA1基因均已整合到水稻基因组中。Westhern blot检测结果显示,Gt1和Ole18启动子都能引导AmA1基因在水稻种子中表达。T1代转基因稻米的氨基酸含量检测结果表明:(1)在Gt1启动子调控AmA1基因表达的转基因水稻中,有9个株系种子中的7种必需氨基酸含量(占种子总干重)比对照有不同程度地提高,最大提高幅度为44.44%;有2个株系种子总氨基酸中的三种限制性必需氨基酸含量(即占总氨基酸的百分比)均比对照显著提高,其中赖氨酸最大提高了5.58%,苏氨酸最大提高了3.12%,甲硫氨酸最大提高了5.58%。(2)在Ole18启动子调控AmA1基因表达的转基因水稻中,有5个转基因株系种子中的7种必需氨基酸含量比对照有不同程度提高,最大提高幅度为15.56%,但只有1个株系的赖氨酸占总氨基酸的百分比对照提高了4.4%,其它株系种子总氨基酸中的必需氨基酸含量没有明显变化。以上结果说明,在Gt1启动子的调控下,AmA1基因能在水稻胚乳中特异性表达,且对提高水稻种子总氨基酸中的3种限制性必需氨基酸含量,具有一定的效果。 5、在不改变氨基酸序列的前提下,根据水稻密码子的偏好性对人乳铁蛋白基因hLF和籽粒苋AmA1基因序列进行了优化设计,调整并去除了会影响基因转录、翻译效率及mRNA稳定性的序列元件,同时对这两个基因的5′端和3′端进行了适当修饰:(1)hLF基因经优化后,编码区核苷酸序列与原来一致性为76.3%,692个密码子中有431个被改变,总的G+C含量和密码子第三位G+C含量分别由原来的53.82%、59.88%提高到56.28%、66.38%;原基因中存在的3个PPSS序列和3处AT富集区全部被去除。并将其5′端的信号肽替换成谷蛋白基因GluB-1的信号肽序列,在3′端添加了一段内质网滞留信号KDEL序列和两个终止密码子TGATAA。(2)AmA1基因优化后、编码区核苷酸序列与原来保持了76.0%的一致性,305个密码子中有192个被改变,总的G+C含量和第三位G+C含量分别从原来的34.43%、29.51%提高到49.95%、71.48%;原基因中存在的17个PPSS序列、3处ATTTA序列和2处AT富集区分别减少到优化后的5、0和1;并在5′端添加了谷蛋白基因Gt1的信号肽序列。 6、人工合成了优化后的hLF、AmA1基因(命名为omhLF、omAmA1)。为了比较hLF、AmA1基因优化前后在水稻中的表达水平差异,分别将优化前后的hLF、AmA1基因转入水稻台粳9号中,共获得PCR阳性植株178株。同时构建了含有omhLF、omAmA1双基因的双T-DNA植物表达载体,并通过农杆菌介导法转入水稻蜀恢527中,经PCR检测,有34株水稻转化植株能扩增出与预期大小一致的omhLF、omAmA1基因片段。由于上述转基因水稻植株目前正处在T0代分蘖期,对其进一步的分子鉴定和品质分析需要过一段时间才能进行。……   
[关键词]:转基因水稻;必需氨基酸;籽粒苋AmA1蛋白;人乳铁蛋白;人工优化
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:福建农林大学2011年