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龙眼体胚发生过程中SERK等胚性相关基因的克隆与表达分析

蔡英卿

  本研究以龙眼(Dimocarpus longan Lour.cv.Honghezi)胚性愈伤组织为材料,克隆SERK等胚性相关基因(SERK基因、14-3-3基因和AGL15基因、LEC基因、CHI-I基因)及其启动子,并采用q-PCR分析其表达水平在龙眼体胚发生过程中的动态变化规律,以期为进一步了解SERK等胚性相关基因在龙眼体胚发生中的调控机制奠定基础。主要研究结果如下: 1龙眼体胚发生过程中SERK等5个胚性相关基因及其启动子的克隆 采用RT-PCR结合RACE方法和TAIR--PCR,克隆得到龙眼胚性愈伤组织SERK等5个胚性相关基因(SERK基因、14-3-3基因和AGL15基因、LEC基因、CHI-I基因)及其启动子:①龙眼胚性愈伤组织SERK基因(DlSERK1),1875bp的cDNA全长序列(登录号:FJ013227),包含一个长为1875bp的ORF;DNA扩增序列长为6009bp(登录号:HM773391.1),包含11个外显子、10个内含子,内含子的剪切位点均符合“GT-AG”规则; DlSERK1基因启动子长1349bp(登录号:HM773391)。DlSERK1基因可能存在的基础启动子区域为第1022~1071bp处,其序列为: 5/-AAGCAGAGGTTGAAAAAGAGGGAAATTTTATTTGGT GTTGCCCAGAAAGG -3/,预测的转录起始点在第1062bp处的C,含有与光响应、低温响应、干旱响应、热应激响应、厌氧响应、真菌激发子响应、生长素响应、赤霉素响应、脱落酸响应、水杨酸响应、茉莉酸甲酯响应及分生组织表达、胚乳表达、生物钟调控、玉米醇溶蛋白代谢调控相关的顺式作用调控元件。②龙眼胚性愈伤组织14-3-3基因(Dl-14-3-3),786bp的cDNA全长序列(登录号:GU573765.1),包含一个长为786bp的ORF;DNA扩增序列长为1859bp(登录号:GU573766),包含4个外显子、3个内含子,内含子的剪切位点均符合“GT-AG”规则; Dl-14-3-3基因启动子长910bp(登录号:GU573766)。Dl-14-3-3基因预测转录起始点在第736bp处的G,含有与光响应、低温响应、干旱响应、厌氧响应、真菌激发子响应、茉莉酸甲酯响应(MeJA响应)、赤霉素响应及胚乳表达、细胞周期调控、生物钟调控、玉米醇溶蛋白代谢调控相关的顺式作用调控元件。③龙眼胚性愈伤组织AGL15基因(Dl AGL15),765bp的cDNA全长序列(登录号:GU584088),包含一个长为765bp的ORF;DNA扩增序列长为2989bp(登录号:JF262162),包含8个外显子、7个内含子,内含子的剪切位点均符合“GT-AG”规则; DlAGL15基因启动子长1454bp(登录号:JF262162)。DlAGL15基因可能存在的基础启动子区域为第1178~1227 bp处,其序列为:5′-TTGCCCCGTTTATAAAATCT TTAAAAAAAGTAAACAACTTGAAAAGAAGA-3′。预测的转录起始点(TSS)在第1218bp处的G.,含有与光响应、低温响应、厌氧响应、热应激响应、防卫及胁迫响应、真菌激发子响应、赤霉素响应、乙烯响应、水扬酸响应、茉莉酸甲酯响应及胚乳表达、分生组织表达、蛋白结合元件、生物钟调控相关的顺式作用调控元件。④龙眼胚性愈伤组织LEC基因(DlLEC),803bp的cDNA全长序列(登录号:GU584089),包含一个长为669bp的ORF,并包含5 -UTR为7bp,3 -UTR为127bp,3poly(A)尾长19bp;DNA扩增序列长为669bp(登录号:HM773393.1),无内含子; DlLEC基因启动子长907bp(登录号:HM773393.1)。DlLEC基因可能存在的基础启动子区域为第725-775 bp处,其序列为:5′-CGTTACAAATT TTAAAGTTGGAGGAGGATGATAGGCATGCATTATCGATG -3′。预测转录起始点在第766bp处的A,含有与光响应、低温响应、热应激响应及胚乳表达、分生组织表达、蛋白结合相关的顺式作用调控元件。⑤龙眼胚性愈伤组织CHI-I基因(DlCHI-I),1125bp的cDNA全长序列(登录号:FJ040804),包含一个长为969bp的ORF,并包含3 -UTR为141bp,3poly(A)尾长15bp;DNA扩增序列长为1759bp(登录号:HM773392.1),包含3个外显子、2个内含子,内含子的剪切位点均符合“GT-AG”规则。Dl-CHI-I基因启动子长878bp(登录号:HM773392.1)。DlCHI-I基因可能存在的基础启动子区域为第690~739 bp处,其序列为:5/- CCACGAGACCCATAACTAACCGGTCC ATGGAAGCCATTTCTA GTGCATGC-3/。预测转录起始点在第730bp处的T,含有与光响应、低温响应、真菌激发子响应元件及胚乳表达、种子特异表达、生物钟调控、玉米醇溶蛋白代谢调控相关的顺式作用调控元件。 2龙眼体胚发生过程中SERK等胚性相关基因的生物信息学分析 龙眼体胚发生过程中龙眼胚性愈伤组织SERK等胚性相关基因(SERK基因、14-3-3基因和AGL15基因、LEC基因、CHI-I基因)的生物信息学分析结果表明:①DlSERK1基因,编码624个氨基酸,属亲水蛋白,含有3个跨膜结构,34个功能位点,4个结构域,无规则卷曲是其主要的二级结构,在N端前26个氨基酸是信号肽,亚细胞定位在细胞膜中,与不同植物来源的SERK1的氨基酸同源性为77%-88%;②Dl-14-3-3基因,编码261个氨基酸,属亲水蛋白,含有25个功能位点(基序),1个结构域,属于14-3-3基因超级家族,α螺旋结构是其主要的二级结构,没有信号肽,亚细胞定位在细胞质中,与不同植物来源的14-3-3的氨基酸同源性较高为73%-96%;③DlAGL15基因编码254个氨基酸,属亲水蛋白,含有15个功能位点,2个保守结构域,属于MADS II型超级家族,α螺旋结构与无规则卷曲结构是其主要的二级结构,亚细胞定位在细胞核与微体中,与不同植物来源的AGL15的同源性为67%-95%;④DlLEC基因,编码222个氨基酸,属亲水蛋白,含有1个跨膜结构,14个功能位点,1个保守结构域,属于H2A超级家族,无规则卷曲是其主要的二级结构,在N端前22个氨基酸是信号肽,亚细胞定位在细胞质与线粒体中,与不同植物来源的LEC1的同源性为35%-70%;⑤DlCHI-I基因编码322个氨基酸,属亲水蛋白,含有1个跨膜结构,有22个功能位点,含有2个结构域,属于糖苷水解酶19家族,无规则卷曲是其主要的二级结构,亚细胞定位在细胞外,与不同植物来源的CHI-I的同源性为70%-98%。 3龙眼体胚发生过程中SERK等胚性相关基因的定量表达分析 3.1龙眼体胚发生过程中SERK等胚性相关基因的定量表达情况 ①DlSERK1在龙眼体胚的8个阶段均有表达,整个变化趋势呈现出经水平翻转180度的躺倒的“了”字型,松散型胚性愈伤组织(Stage 1),子叶型胚(Stage 8)以及不完全胚性紧实结构(Stage 3)的表达量相对较高,鱼雷型胚(Stage 7)的表达量相对较低;②Dl-14-3-3在龙眼体胚的各阶段均有表达,整体转录水平的变化趋势呈不规则的“倒S”形,其中在松散型胚性愈伤组织(stage 1)和心形胚(stage6)及鱼雷形胚(stage7)相对高表达,构成2个表达高峰,而在球形胚(stage5)和子叶形胚(stage8)相对低表达,组成2个表达低谷;③DlAGL15整体转录水平的变化趋势呈现出单峰型,松散型胚性愈伤组织(Stage 1)到心形胚(Stage 6)的表达趋势以上升为主,从心形胚(Stage 6)到子叶型胚(Stage 8)AGL-15基因表达量呈逐渐降低的趋势;④DlLEC在龙眼体胚发育的不同时期表达量高低不同,呈现出单峰型,除了属龙眼体胚中期的心形胚(Stage 6)和鱼雷型胚(Stage 7)表达量相对较高,其余的6个阶段表达量相对较低;⑤DlCHI-I表达量整体的变化趋势呈字母“M”状双峰型,不完全胚性紧实结构(Stage 3)和心形胚(Stage 6)分别出现了峰值,子叶形胚(Stage 8)的表达量相对较低,是8个阶段的最低值。 3.2龙眼体胚发生过程中龙眼体胚发生过程中SERK等胚性相关基因表达情况相互之间的联系 本研究发现,龙眼体胚发生发育的8个阶段,SERK基因与14-3-3基因两者表达特性十分相似,均呈现出双峰形,第1个表达高峰均出现在松散型胚性愈伤组织(stage 1),只是14-3-3基因第2个表达高峰出现在体胚发育的中期阶段(心形胚Stage6-鱼雷形胚Stage7),比SERK基因早两个阶段出现,而SERK基因第2个表达高峰则出现在体胚发育的末期阶段(子叶形胚Stage8),SERK基因与14-3-3基因两者有一定的时间差。AGL15作为转录因子处于SERK1的上游,在龙眼体胚不同发育阶段中Dl-AGL-15基因的转录水平在心形胚阶段呈现表达高峰,而SERK基因在心形胚阶段之后的子叶形胚(Stage8)也出现表达高峰. 总之,本研究首次在龙眼上克隆SERK等5个胚性相关基因,对其结构和功能进行了预测,研究了基因在体胚发生过程中的表达规律,并且首次在木本体胚中探讨SERK等5个胚性相关基因的互作,同时还克隆到了SERK等5个胚性相关基因启动子部分序列,有助于今后对龙眼体胚发生机制的更深入探索,也为龙眼遗传改良提供目的基因资源。……   
[关键词]:龙眼;体胚发生;胚性相关基因;克隆;实时荧光定量PCR
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:福建农林大学2011年