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PEG修饰ω-干扰素与尿酸氧化酶的制备、纯化、结构分析与生物活性的研究

邱蕊

  聚乙二醇(PEG)已被广泛应用于食品、饲料、医药、化妆品、化纤等领域。PEG由于其良好的水溶性,与许多有机物组分有良好的相容性。 重组人ω-干扰素(rhIFN-ω)由于具有免疫调节,抗病毒作用,可用来治疗乙型肝炎、丙型肝炎以及癌症。目前在食品科学、医药临床应用最多的是α-干扰素(IFN-α),如IFN-α-2a, IFN-α-2b。有研究发现在治疗某些疾病方面IFN-ω比IFN-α作用效果更好。随着对ω-干扰素研究的深入,hIFN-ω基因已在E.coli、乳酸乳球菌、CHO细胞、离体昆虫细胞Sf9的杆状病毒、毕赤酵母等表达系统中得到了成功表达。 本论文通过2-亚氨基硫烷盐酸盐(Traunt’s Reagent,IT)修饰ω-干扰素后引入巯基,再通过马来酰亚胺基聚乙二醇(M-MAL)修饰引入的巯基。分析比较聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)IT连接修饰IFN-ω、聚乙二醇醛(M-ALD)直接修饰与IFN原蛋白的理化性质,药效及药代活性。采用Superdex 200凝胶柱过滤分析修饰产物,得出最佳的修饰条件。通过AKTA蛋白纯化系统与Superdex 200凝胶过滤柱收集单修饰IFN-ω。采用凝胶过滤分析及SDS-PAGE(对钠十二烷基的硫酸盐聚丙烯酰胺凝胶电泳法)检测修饰产物的纯度。 结果表明,IFN-ω、IT、M-MAL-20K的最佳修饰比例为1:4:4;IFN-ω、IT与M-MAL-40K的最佳修饰比例为1:2:2;IFN-ω、NaCNBH3与M-ALD-20K的最佳修饰比例为1:100:10;IFN-ω、NaCNBH3,与M-ALD-40K的最佳修饰比例为1:60:6。 运用AKTA纯化收集及Superdex 200 prep grade(16×60 i.d.)凝胶柱分离纯化PEG单修饰IFN-ω。SDS-PAGE电泳及高效液相色谱凝胶分析检测结果表明:PEG单修饰ω-干扰素的纯度均超过95%。运用胰蛋白酶酶切图谱确定PEG修饰位点。用圆二色光谱(CD)与荧光光谱(FL)测定IFN-ω与其PEG修饰产物的二级结构与三级结构。结果表明:M-MAL与M-ALD修饰位点均可能在Lys-43或Lys-46;PEG修饰后IFN-ω的结构与原蛋白非常接近;药效分析证明经Traunt’s Reagent引入巯基后,再使用M-MAL修饰比直接使用M-ALD修饰的效果好;经PEG修饰后,药代时间延长,其中PEG-40K的药代时间比PEG-20K更长。 尿酸氧化酶(UOX)用来治疗痛风及高尿酸血症。由于UOX含有3个自由巯基,直接修饰会影响其活性,用2,2 -二硫二吡啶(Aldrithiol)与UOX的自由巯基暂时结合。除去未结合的Aldrithiol后,用IT与UOX连接引入自由巯基,再用M-MAL修饰此巯基位点。最后用磷酸三氯乙酯(TCEP)除去结合的Aldrithiol。 用与IFN-ω同样的分离方法,分离纯化PEG修饰UOX。SDS-PAGE电泳检测收集的PEG修饰产物。结果表明经PEG修饰后,其多修饰产物的分子量增加许多。以尿酸为底物,分别检测尿酸经UOX与其修饰产物分解后,产物尿囊素在293 nm处的紫外吸收。结果表明经PEG修饰后,虽然其体外活性比原蛋白降低,但是其体内代谢时间比原蛋白明显延长。 随着PEG修饰技术的研究及深入,相信越来越多的PEG将被应用于食品、医药、化工等领域。……   
[关键词]:ω-干扰素;尿酸氧化酶;2-亚氨基硫烷盐酸盐;PEG修饰
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:福建农林大学2011年