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藏族原发性高血压的遗传学基础

李广平

  第一部分藏族原发性高血压候选基因的鉴定 背景: 原发性高血压是由遗传和环境因素共同作用引起的复杂性状多基因疾病。肾素-血管紧张素系统在血压的调节、水电解质平衡的维持中起重要作用,所以是原发性高血压候选基因的主要来源,尤其是此系统中的血管紧张素原(AGT)、血管紧张素转换酶(ACE)以及醛固酮合成酶(CYP11B2)基因,大量的研究都证明它们与原发性高血压的遗传易感性存在不同程度的相关,但这种关联在不同的人群中却不能很好地验证。因此,在不同的种族人群中对结果进行验证有着重要意义。 方法: 本文以拉萨地区的藏族人为研究对象,对1176例样本进行病例-对照关联分析,原发性高血压(EH)组534例,正常对照(control)组642例。应用PCR-RFLP,PCR-SSCP结合PCR测序技术对3个EH候选目标基因的7个SNP进行分型。采用多位点的单倍型预测和交互效应分析方法,检测与EH相关的SNP特异单倍型组合,并探索可能存在的基因-基因间的相互作用。本文首次引入多元简约法(MDR),可大大提高结果分析的力度和可信性。结果: 单个位点分析:肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)中,醛固酮合成酶基因(CYP11B2) C-344T位点的基因型频率和等位基因频率在两组间的差异显著(P=0.002和P<0.01)。携带-344C等位基因的个体具有较高的EH发病风险(OR=1.436;95%CI,1.188-1.734)。 连锁分析:对RAAS系统3个基因中的7个SNP进行连锁分析。在两组中,ACE I/D和A2350G两位点间存在中度连锁(EH组D =0.70和Control组D’=0.71) 基因-基因间交互效应分析及单倍型预测:应用MDR软件,在RAAS系统基因中选择了4个SNP,包括ACE I/D, A-240T, A2350G和CYP11B2 C-344T位点。其中ACEI/D和A2350G存在强交互效应,同时与C-344T具有中等程度交互效应,最佳MDR模型包括:ACEI/D和A2350G。对最佳MDR模型中2个SNP进行单倍型分析,经Bonferroni校正(P<0.013,0.05/4),发现在EH组中单倍型H3(D-A,等位基因按照I/D和A2350G顺序组合单倍型)的频率显著高于Control组(9.2%-vs.2.1%, P<0.001)。结论: RAAS中醛固酮合成酶基因(CYP11B2) C-344T位点和与EH相关,携带-344C等位基因的个体具有较高的EH发病风险。ACE I/D和A2350G存在强交互效应,单倍型D-A(等位基因按照1/D和A2350G顺序组合单倍型)在高血压组中出现的频率明显高于对照组,为易感单倍型。 第二部分醛固酮合成酶基因-344位点等位基因的功能研究 背景: 为进一步证实和解释遗传关联分析的结果,鉴定醛固酮合成酶基因-344位点不同等位基因对基因调控区转录活性的影响,本研究构建了含醛固酮合成酶基因C-344T位点不同等位基因的萤光素酶报告基因重组质粒,体外转染人胚肾293T细胞并测定其瞬时表达萤光素酶活性,对醛固酮合成酶基因C-344T位点不同等位基因进行功能研究,以期进一步阐明基因结构和表型之间的内在联系。 方法: 从基因组DNA中用PCR方法扩增,获得含有人醛固酮合成酶基因启动子区C-344T位点不同等位基因的DNA片段。所得目的片段亚克隆入 pMD18-T vector.将pGL3-Basic vector和重组pMD18-T质粒经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切后得到的含粘端的片段相连接,得到含不同等位基因的人醛固酮合成酶基因C-344T位点序列的萤光素酶报告基因重组质粒。利用真核基因转染技术,将构建好的重组质粒与内参照质粒pRL-TK共转染人胚肾293T细胞,探讨位于醛固酮合成酶基因基因5’调控区的SNP位点不同等位基因对报告基因转录活性的影响。 结果: 体外转染增殖期人胚肾293T细胞细胞,瞬时表达结果显示:含等位基因-344C重组质粒的报告基因荧光素酶表达活性高于含等位基因-344T重组质粒,并均低于pGL3-control plasmid。 结论: 体外转录活性研究显示位于醛固酮合成酶基因5’调控区的SNPC-344T可能参与基因的转录调控。-344C等位基因可能是藏族原发性高血压的易感基因。 第三部分藏族原发性高血压全基因组关联研究 背景: 全基因组关联分析(Genome-wide association study,GWAS)是应用人类基因组中数以百万计的单核苷酸多态性(single nucleotide ploymorphism,SNP)为标记进行病例对照分析,以期发现影响复杂性疾病发生的遗传特征的一种新策略。近年来,随着人类基因组计划的实施以及基因芯片技术的发展,人们己通过GWAS方法发现并鉴定了大量与人类复杂性疾病关联的遗传变异,为进一步了解控制人类复杂性疾病的遗传特征提供了重要的线索。目前,已进行了多个关于高血压的GWAS,但仍未成功的定位高血压的致病基因。 方法: 本文结合了高通量芯片分析和高效DNA混合池策略的SNP-MaP (SNP Microarrays and Pooling)方法,利用Affymetrix Genome-wide Human SNP Array 6.0对200例藏族EH患者与200例藏族正常对照进行了全基因扫描。并对患者组和对照组各位点的等位基因频率进行比较。筛选出有显著差异的位点后,在300例藏族EH患者和300例健康对照中,进行群体验证。用直接测序不PPCR-RFLP的方法,鉴定出各个基因型和相应等位基因的频率。以期阐明基因多态性与藏族EH之间的关系。 结果: 在全基因组的遗传标记中,5个标签位点的等位基因频率在患者组与对照组之间存在显著差异(P<9.2×10-8)。其中rs9865108位于基因SUCNR1的下游,与基因SUCNR1的距离不至(?)20kb, rs17136827位于基因CAMKID第一内含子内,其它3个SNP位点在上下游50kb内未发现基因序列。用直接测序和PCR-RFLP的方法进行群体验证,发现rs 17136827和rs 1866525两个位点的基因型和等位基因频率分布在两组间均无统计学差异;rs9865108的基因型频率和等位基因频率在两组间的差异显著(P=0.048和P=0.026),携带C等位基因个体具有较高的EH发病风险(OR=1.570; 95%CI,1.053-2.347)。rs12541835的基因型频率和等位基因频率在两组间的差异显著(P=0.013和P=0.007),携带C等位基因个体具有较高的EH发病风险(OR=2.241; 95%CI,1.233-4.072)。rs4547758基因型频率和等位基因频率在两组间的差异显著(P=0.007和和P=0.010),携带C等位基因个体具有较高的EH发病风险(OR=1.380; 95%CI,1.080-1.764)。 结论: 本研究证实Affymetrix Human SNP芯片和高效混合池策略结合的SNP-MaP能够有效地大范围分析人类EH易感基因。rs9865108、rs12541835和1(?)4547758与藏族EH易感相关。……