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慢性饮酒及戒断对大鼠背侧纹状体LTD的影响及其作用机制

崔胜忠

  药物成瘾定义为不计后果的强迫性的服药行为,成瘾患者的生活目标局限于获得、使用药物和从药物使用中恢复,而置生活角色的失败、生命健康和其它问题于不顾。药物滥用成为现今世界范围内危害人类健康、危及社会安定的重要医学和社会学问题。在成瘾药物中,酒精是人类历史上应用最为广泛的成瘾药物。与其他成瘾类物质—如:可卡因、尼古丁—相比,酒精的作用更为广泛,已有的报道包括作用于许多配体门控和电压门控的离子通道。因而,酒精对于中枢神经系统的作用机制很难被确定。对于其作用机制的进一步理解有助于为酒精成瘾或酗酒的治疗打下基础。 成瘾的一个重要特征就是它顽固的持久性。尽管有的个体能够停止强迫性的服用烟草、酒精或者其它非法的药物,绝大部分人非常缺乏对于成瘾药物的抵抗力。治疗药物成瘾的核心问题是即使患者戒除药物很久了,复吸(relapse)—常常是由于药物相关提示信号的诱导—的几率仍然非常高。 特定的药物信号与特定的(服药)行为之间的这种关联性提示我们至少部分药物成瘾的机制涉及到联合型的学习记忆过程。因而,成瘾越来越被看作是一种病态的学习过程,其所包含细胞和突触机制与正常学习记忆过程中的类似。最为广泛研究的学习记忆细胞模型是长时程突触增强(long-term potentiation, LTP)和长时程突触抑制(long-term depression, LTD)。突触可塑性是环境刺激所引起的神经调适过程所必需的,在许多经验依赖的活动(experience-dependent activity)改变中发挥重要的作用。因此,药物滥用通过改变相关脑区的突触功能和可塑性导致行为的长期改变的设想就变得很有吸引力。 在药物成瘾的相关脑区中,腹侧纹状体,即:伏隔核(nucleus accumbens, NAc)在介导药物的奖赏效应和强化效应方面已经得到了很好的确立。近来,背侧纹状体也被认为可能参与了成瘾的高级阶段,即:药物使用向强迫性、习惯性的病理转变过程。基于这个假设,我室的前期研究工作曾观察到慢性饮酒和戒断能改变背侧纹状体的LTD诱导。但是其中的分子机制尚不明了 与突触可塑性相关的细胞内信号分子是成瘾产生的有吸引力的可能机制,因为这些细胞内信号分子能把药物诱导的信号转化为神经功能的长时程改变,并能最终重塑神经通路。这其中,有报道ERK (extracellular signal-regulated kinase)信号通路在LTP的诱导过程具有重要的作用。譬如:在海马,可诱导LTP的刺激能够有力的激活ERK;而药理学抑制MEK,一种ERK的上游激活因子,可抑制LTP的产生。有关ERK参与突触可塑性的例子还可以在其它一些脑区发现一如:小脑的LTD、视皮层的LTP等。并且,有关研究曾表明ERK信号通路是酒精作用的一个重要的细胞内靶点。例如:分别在培养的皮层神经元和在体小鼠皮层上发现急性灌流酒精可减轻的ERK/MAPK的活化。 基于上述的实验结果,我们的科学假设是:酒精可通过影响ERK的活性而改变皮层-纹状体通路的突触可塑性。在本实验中,我们首先研究了背外侧纹状体(dorsolateral striatum, DLS)的LTD是否是ERK激酶依赖性的;其次,我们观察了慢性饮酒和戒断对ERK激活的影响;最后,我们分析了慢性饮酒和戒断对ERK激活和LTD诱导之间的相关性,并初步探讨了ERK激酶作为治疗酗洒的潜在靶点的可行性。 目的:确立稳定诱导背侧纹状体LTD的实验方法,探讨纹状体LTD与MAPK (ERK/JNK/p38)信号通路的关系 方法:健康、雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠24只,体重220-250 g,随机分为4组:对照组(正常ACSF灌流)大鼠6只;ERK抑制剂组(20μM U0126预处理)大鼠6只;JNK抑制剂组(20μM SP600125预处理)大鼠6只;P38抑制剂处理组(10μM SB203580预处理)大鼠6只。用振动切片机切取大鼠背侧纹状体的冠状面脑片,厚约400μm。所采用的强直刺激(HFS)参数为:4串,串长1s,频率100Hz,每串间隔20s,刺激波宽0.1ms,刺激强度为最大刺激强度的1.2~1.4倍,约为120~220μA。 结果:在对照组,HFS之后50-60 min大鼠纹状体的PS (population spike)平均幅值降低为基线水平的49.8±6.4%,说明可以成功诱导LTD;U0126预处理组,其50-60 min post-HFS的PS平均幅值为基线水平的96.3±6.9%,说明LTD被取消;在SP600125预处理组,HFS之后50-60 min大鼠纹状体的PS平均幅值降低为基线水平的56.1±7.2%,说明LTD的诱导不受影响;在SB203580预处理组,HFS之后50-60 min大鼠纹状体的PS平均幅值降低为基线水平的65.1±7.2%,说明LTD的诱导亦不受影响。另外,western-blot结果也显示,HFS刺激可以使ERK激酶磷酸化增加,而U0126可抑制这种改变。当把U0126的预处理改成HFS后处理时,LTD的幅度与对照组相比无显著改变。 结论:HFS可稳定的在大鼠背外侧纹状体(dorsolateral striatum. DLS)诱导出LTD。DLS的LTD是ERK激酶依赖性的,而与MAPK信号通路的另两个激酶-JNK和p38-无关。ERK激酶的激活是纹状体LTD的诱导阶段所必需的,并不参与LTD的表达和维持过程。 目的:文献表明ERK激酶是酒精作用的重要的细胞内靶点,拟阐明慢性饮酒及戒断对ERK激酶的磷酸化有何影响。 方法:健康、雄性SD大鼠35只,体重150-170 g,随机分为7组:对照组、饮酒10天组(CEI10)、饮酒20天组(CEI20)、饮酒30天组(CEI30)、戒断1天组(WD1)、戒断3天组(WD3)、戒断7天组(WD7),每组大鼠各5只。其中对照组大鼠正常饮用自来水;饮酒组大鼠以6%(v/v)酒精水溶液代替自来水为唯一饮用品(分别持续10、20、30天);戒断组大鼠在饮用6%(v/v)酒精水溶液30天后,改为饮用自来水(分别持续1天、3天、7天)。在实验时,取大鼠背外侧纹状体脑组织,以werstern-blot方法检测pERK、ERK蛋白的含量。 结果:以对照组的pERK/ERK的比值作为标准,CEI10组大鼠的pERK水平降低到了0.54±0.05(n=5,p<0.05);CEI20组大鼠的pERK水平下降到了0.43±0.08(n=5,p<0.05);CEI30组大鼠的pERK水平降到了0.76±0.07(n=5,p<0.05)。这三组与对照组相比均有显著性差异。与此相反的是,pERK水平在WDl组的大鼠有了显著提高,为1.32±0.08(n=5,p<0.05 versus CTL)。但是,pERK水平在WD3组(0.96±0.10,11=5)和WD7组(0.88±0.12,n=5)的大鼠上没有统计学上的明显改变。 结论:在背外侧纹状体,慢性饮酒可降低ERK的磷酸化水平,而酒精戒断会引起ERK磷酸化水平的短暂升高。 目的:确定慢性饮酒及戒断是否通过ERK激酶影响到DLS的LTD诱导,进而干扰纹状体行为习惯的学习和形成,导致酗酒行为。探讨以ERK激酶作为治疗酗酒的分子靶点的可能性。 方法:健康、雄性SD大鼠30只,体重150-170g。随机分为6组(5只大鼠/组):对照组1(饮水10天,后三天侧脑室注射等体积ACSF);CE110+DMSO处理组(饮酒10天,后三天侧脑室注射等体积DMSO);CE110+U0126处理组(饮酒10天,后三天侧脑室注射100μg U0126);对照组2(饮水31天,后三天侧脑室注射等体积ACSF);WD1+DMSO处理组(饮酒30天后戒断1天,后三天侧脑室注射等体积DMSO);WD1+U0126处理组(饮酒30天后戒断1天,后三天侧脑室注射100μg U0126)。以werstern-blot方法检测pERK/ERK激酶的变化,同时以电生理方法观察DLS的LTD诱导的改变,确定两者之间的关联性。 结果:慢性饮酒10天在降低ERK磷酸化水平的同时抑制了DLS的LTD诱导;酒精戒断1天在增加ERK磷酸化水平的同时促进了DLS的LTD诱导,侧脑室灌注ERK激酶抑制剂U0126可以逆转这种变化。实验中还观察到,侧脑室灌注U0126可减少大鼠的饮酒量,并能减轻酒精戒断症状的评分。 结论:慢性饮酒和戒断通过持续性的改变ERK激酶的磷酸化水平而改变大鼠DLS的LTD诱导,初步分析显示ERK激酶可以作为治疗酗酒的细胞内靶点。 综上所述,本工作的主要创新之处在于: 1、首次报道了与药物成瘾和习惯行为密切相关的脑区DLS的LTD诱导是ERK/MAPK激酶依赖性的,而与JNK/MAPK、p38/MAPK无关。ERK激酶的激活是DLS的LTD绣导所必需,但不参与其表达和维持阶段。 2、绕开了难以确定的酒精作用比较广泛的细胞膜受体和离子通道这个话题,探讨酒精影响的细胞内信号通路。在慢性饮酒和戒断动物模型的基础上,描述了ERK磷酸化的变化过程。即:饮酒过程中受到抑制,戒断后有一个短暂的“反跳”过程。 3、确立了慢性饮酒及戒断可经由ERK激酶信号系统改变大鼠DLS的LTD诱导,对于理解酒精成瘾、酗酒的分子机制具有重要意义。初步分析了ERK激酶作为治疗酗酒的分子靶标的可行性。……   
[关键词]:酒精;背侧纹状体;突触可塑性;LTD;ERK/MAPK
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:南京医科大学2011年