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三疣梭子蟹血卵涡鞭虫单克隆抗体研制及其初步应用

查智辉

  血卵涡鞭虫是近年引起三疣梭子蟹、拟穴青蟹等经济甲壳类死亡的重要病原,其宿主范围分布广、致病性强,死亡率极高,给浙江沿海三疣梭子蟹、拟穴青蟹的大规模养殖造成了重大的经济损失。通过临床取样,大部分病蟹肌肉白浊、蟹盖内充满大量乳白色液体等典型的临床症状,显微镜检发现血淋巴细胞数量急剧下降,血淋巴大部分被和血细胞大小形态相似的寄生虫体代替,由于该寄生虫在潜伏期和感染初期虫体量少,而且在某些生活史阶段与蟹类血细胞形态差异很小,普通显微镜下很难准确区分虫体,给该寄生虫的临床诊断造成了很多不便。目前一些免疫学的新方法,新技术如体外培养、抗原提纯、单克隆抗体技术、标记技术等在寄生虫研究中的应用,为寄生虫病的免疫诊断你和应用创造了有利条件,本研究的目标主要是通过血卵涡鞭虫单克隆抗体的研制,建立相关的免疫标记技术,从而实现对该寄生虫病原进行快速和精确检测,以期解决该寄生虫病的早期诊断困难问题,同时通过免疫没技术的运用,开展大规模临床样品的调查,探索该病原的生活史特征及传播途径。 本研究分两部分。 第一、血卵涡鞭虫单克隆抗体的研制及特异性鉴定。试验选取浙江沿海三疣梭子蟹暂养基地,人工养殖场患“牛奶病”三疣梭子蟹和“黄水病”拟穴青蟹中分离的血卵涡鞭虫,利用杂交瘤单克隆抗体技术制备了抗血卵涡鞭虫的虫体单抗,筛选出了3株能稳定分泌抗血卵涡鞭虫单克隆抗体的细胞株,分别命名为2B_2、3G_4、4G_7,上述单抗经检测,均具有ELISA反应特性,杂交瘤细胞上清下限效价达到了5.12×10~(-4)。单克隆抗体亚类鉴定,表明三者均为IgG类抗体,用筛选的杂交瘤细胞株制备小鼠腹水抗体,其腹水效价达到了8.00×10~(-4)。3株杂交瘤细胞株经克隆化后连续传代40代,细胞生长状态良好,测其OD492滴度仍在5.12×10~(-4)之上,说明有较好的稳定性。用建立的间接ELISA方法对血卵涡鞭虫抗原和蟹血淋巴细胞进行检测,结果显示3株单抗只与血卵涡鞭虫抗原发生特异性反应,而不与血淋巴细胞发生交叉反应,进一步利用单克隆抗体建立间接荧光抗体方法对单抗特异性进行鉴定,阳性虫体被染上黄绿色荧光,而正常三疣梭子蟹血淋巴则未被染色,显示了3株单抗有较好的特异性。 第二、血卵涡鞭虫单克隆抗体的初步应用。以针对血卵涡鞭虫的特异性单克隆抗体为捕获抗体,纯化的抗血卵涡鞭虫的兔抗血清为检测抗体,初步建立了检测血卵涡鞭虫的双抗体夹心ELISA方法。方阵滴定确定最佳反应条件:包被的单克隆抗体浓度为10μg/mL,多抗兔血清工作浓度为14.30μg/mL,待检样品稀释度为1:800;HRP-羊抗鼠IgG按1∶20000稀释。用建立的ELISA方法对86份已知背景样品进行检测,阳性检出为97.6%,血卵涡鞭虫抗原检测的灵敏度为100pg/mL,结果表明,建立的双抗体夹心ELISA方法灵敏度高,特异性强,可用于诊断三疣梭子蟹牛奶病血卵涡鞭虫的检测。……   
[关键词]:三疣梭子蟹;血卵涡鞭虫;单克隆抗体;间接免疫荧光试验(IFA);双抗体夹心ELISA法
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:浙江海洋学院2011年