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猪圆环病毒2型衣壳蛋白病毒样颗粒的制备及其免疫原性的研究

尹双辉

  猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2, PCV2)的感染与断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)的发生密切相关。PMWS主要发生在5~18周龄仔猪,患病猪主要临床表现为生长缓慢、体重减轻、呼吸困难、黄疸、腹泻、皮炎、淋巴结肿大和病毒血症,致死率在1%~10%之间。PCV2感染呈世界性分布,已成为危害养猪业健康发展的重要病因之一。国内外相继注册了包括灭活疫苗、嵌合疫苗和亚单位疫苗,在预防PCV2感染中发挥了重要作用。由于抗原制备成本居高不下,导致市场供应的各种疫苗单头份价格在8~48元人民币之间,高昂的疫苗价格严重制约了PCV2疫苗的推广使用。根据PCV2 ORF2基因编码的主要免疫原性蛋白Cap具有在体外自我组装成病毒样颗粒(Virus-like particles, VLPs)的特点,结合SUMO蛋白表达技术,我们首次利用E.coli表达的重组蛋白在体外制备Cap蛋白VLPs,为研制PCV2 VLPs疫苗奠定了基础。 1.将PCV2 ORF2编码完整Cap蛋白基因克隆到带有小泛素样蛋白(SUMO)和多聚组氨酸(6×His)的原核表达载体pSK中,转化克隆菌株JM109感受态细胞,将鉴定为阳性的重组质粒命名为p-SMK-Cap。将p-SMK-Cap转化到表达感受态细胞BL21-Condon plus (DE3)中表达重组蛋白。利用SDS-PAGE电泳可观察到部分重组蛋白以水溶性形式表达,亲和层析纯化目的蛋白以单一特异性条带出现,大小约为43 kDa,免疫印记试验和ELISA试验均证实重组表达的Cap蛋白具有良好的反应原性,命名为His-SUMO-Cap。 2.利用SUMO蛋白酶切除重组蛋白His-SUMO-Cap上的SUMO标签,亲和层析纯化后获得不带有任何氨基酸残基的“天然Cap蛋白(nCap)”,大小为23 kDa。利用透射电镜观察nCap蛋白能够自我组装形成直径17nm大小的VLPs,形态结构类似与亲本PCV2 Cap蛋白,它能够和PCV2血清抗体反应并形成抗原抗体复合物,说明E.coli表达的重组蛋白能够形成正确病毒衣壳结构。 3.将His-SUMO-Cap、nCap和InvCap疫苗分别免疫小鼠。利用间接ELISA可检测到Cap蛋白特异性抗体。检测发现,外周血中的细胞因子IL-4、IL-10、IL-12和IFN-γ表达量有所上调,利用流式细胞仪检测三种Cap抗原免疫小鼠后21天和28天时外周血T淋巴细胞亚群的变化的结果表明,空白组CD3~+T淋巴细胞总数与抗原免疫组之间统计学差异显著(P<0.05),而不同抗原之间的CD3~+T淋巴细胞总数、CD3~+/CD4~+和CD3~+/CD8~+淋巴细胞总数和百分率差异不显著。 4.利用纳米粒度仪检测制备的PCV2 nCap VLPs大小,然后以其作为抗原接种猪,以InvCap疫苗作为免疫对照。PCV2 nCap VLPs抗原免疫猪后产生的抗体消长规律同InvCap疫苗基本一致,免疫后的猪在7天后发生抗体阳转,直到免疫后28天,抗体仍然表现为上升趋势。淋巴细胞增殖试验和流式细胞仪的检测结果表明,不同类型的Cap抗原可以刺激机体的Th1和Th2型细胞免疫反应,IL-4和IL-10和IFN-γ在外周血中的含量明显高于未免疫猪。以上研究结果证明体外制备的PCV2 Cap VLPs疫苗有确实的刺激机体体液免疫和细胞免疫反应的能力。……   
[关键词]:猪圆环病毒2型;衣壳蛋白;病毒样颗粒;基因工程疫苗;免疫原性
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国农业科学院2011年