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北京地区犬细小病毒病的分子流行病学调查研究

柏丽华

  近年来,随着我国宠物群体的迅速扩大,宠物病严重威胁着该群体的健康,对行业造成了巨大的损失。犬细小病毒病为一种烈性传染病,通常发病率为50%~100%,死亡率为10%~50%,是犬群危害性最大的疾病之一。该病病原为犬细小病毒(CPV),过去的三十年中,CPV进化较快,在DNA病毒中比较少见。而目前使用的商品化疫苗保护力下降,常出现免疫失败,因此,本研究对2010~2011年北京市犬细小病毒病的分子流行病学进行调查及遗传差异分析,对今后研究CPV的抗原变异以及开发更有效的疫苗具有十分重要的指导意义。 本实验建立了快速检测CPV的PCR方法,最低能检测出38.4 pg/mL的病毒DNA。随机采集2010~2011年来自北京不同地区的327个临床样品(粪便、尿液、唾液、口鼻分泌物、血清等),应用已建立的PCR检测方法,共筛选出51个CPV阳性样品,检出率为15.6%,胶体金免疫层析法检测阳性率为12.2%,可见PCR方法检测CPV具有更高的灵敏性。 VP2作为CPV核衣壳蛋白的主要编码基因,它包含结构蛋白所有的中和抗原位点,因此选择VP2基因作为犬细小病毒病分子流行病学调查的靶基因。通过对51个阳性样品的VP2全长基因的克隆及序列分析,结果发现,样品与参考毒株的核苷酸序列、氨基酸序列的同源性分别是98.2%~100%和97.7~100%。样品之间核苷酸、氨基酸的同源性分别为99.0%~100%和98.8~100%,表明北京地区2010年以来的VP2基因变异较少。亚型分析表明CPV主要基因型仍是CPV-2a,占90.2%(46/51),CPV-2b的比例很低,占9.8%(5/51),未发现CPV-2c和CPV-2。与经典的CPV-2a/b参考株相比,北京流行株VP2基因主要以散发的点突变为主,包括555Ile→Val、324Tyr→Ile、267Phe→Tyr、440Thr→Ala、101Thr→Ile、87Leu→Met和139Val→Ile,个别样本分别在187(Pro→Ile、Gln)、188(Ala→Gln)、308(Val→Ile)位发生置换。DNAStar分析显示,除了Ile 101、Ile 139、Ile 187、Gln 187、Gln 188、Tyr 267位突变的意义不大以外,Met 87、Ile 308、Ile 324、Ala 440、Val 555均处于VP2蛋白潜在抗原表位区域,因此其变异具有非常重要的生物学意义。遗传进化树分析结果显示,51例样品的VP2序列均处于CPV分支,不与FPV在同一分支。在CPV分支中,与台湾、北京、武汉、南京分离株的亲缘关系较近,与巴西、法国、日本及越南,美国、意大利、波兰分离株亲缘关系较远。 按照氨基酸同源性分析,将同源性100%的样品归为一组,51个样品可分为6组,分别取各组代表A1、B4、B6、B8、B25、E4共6份粪便样品,通过同步培养法感染胎猫肾细胞F81,结果成功分离到5株病毒株,对分离的病毒进行形态学观察、PCR检测、IFA试验及TCID_(50)检测,证实分离毒株为CPV。将分离的5株毒株分别命名为CPV-BJ-A1、CPV-BJ-B4、CPV-BJ-B8、CPV-BJ-B25和CPV-BJ-E4。通过VP2全长基因测序分析表明,5个分离株均为CPV-2a亚型,而目前普遍使用的商品化疫苗株为CPV-2亚型,推测流行毒株与疫苗株的差异可能是造成目前疫苗免疫力低下的原因之一。 综上所述,对近两年来北京市宠物犬细小病毒病的分子流行病学调查及遗传差异分析,为探讨临床免疫失败的原因及有针对性地开发宠物用CPV疫苗奠定了理论基础。……   
[关键词]:犬细小病毒;VP2基因;PCR;序列分析;分离与鉴定
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中国农业科学院2011年