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棉花体细胞胚发生受体类激酶基因的克隆与功能分析

石雅丽

  棉花是世界上重要的经济作物之一,而目前其经济价值主要体现在它的生殖器官中,因此,对棉花生殖器官发育的分子机理进行研究,如花器官发育、纤维发育,尤其是雄蕊的发育,对培育新的棉花品种、提高棉花产量与改善棉纤维品质具有重要意义,从而可推动我国棉花产业的快速发展。 体细胞胚发生受体类激酶(Somatic embryogenesis receptor-like kinase,SERK)是膜富亮氨酸重复序列类受体蛋白激酶(leucine-rich repeat receptor-like kinases, LRR-RLKs)的亚家族,SERK具有典型的胞外信号受体结构域、疏水跨膜结构域以及胞内Ser/Thr激酶结构域,在体细胞胚发生、无融合生殖、孢子体发育以及植物响应生物和非生物胁迫等方面起着重要作用。 本研究利用同源克隆的方法,在棉花基因组中克隆到两个不同的棉花(Gossypium hirsutum) SERK基因(GhSERK)片段,根据核苷酸分析,分别命名为GhSERK1和GhSERK4。同时,Southern Blot结果显示,在棉花基因组中至少存在2-3个SERK基因。已获得GhSERK1基因的全长序列,GhSERK1全长基因组序列为6920bp,其cDNA全长为2502bp(GenBank登录号: HQ621831.1),其中5’UTR为424bp,CDS为1884bp,3’UTR为194bp。推断该基因编码627个氨基酸残基,蛋白分子量大约为69KD,等电点为5.55。GhSERK1蛋白的1-241氨基酸残基编码胞外结构域,242-264氨基酸残基编码跨膜结构域,265-627氨基酸残基编码胞内激酶结构域,其中在第28与29位氨基酸残基间存在一个信号肽切割位点,所以1-28个氨基酸残基编码一段信号肽序列。生物信息学分析该基因编码一个Thr/Ser激酶。核苷酸与蛋白质BLAST结果表明,GhSERK1基因包含11个外显子和10个内含子;外显子1编码信号肽(signal peptide, SP);外显子2编码亮氨酸拉链结构(leu zipper, ZIP);外显子3~6编码5个富亮氨酸重复序列(leu-rich repeat, LRR),其中除外显子4编码LRR2和LRR3外,其他每一个外显子编码一个LRR;外显子7编码含SPP(Ser-Pro-Pro)基序的富脯氨酸结构域;外显子8编码跨膜结构域(transmembrane region, TM);外显子9~11编码胞内激酶活性结构域。Southern Blot结果显示,GhSERK1基因在棉花基因组中为单拷贝。 表达谱分析发现,GhSERK1基因在棉花整个生长发育过程以及各组织中均表达,但在不同组织中的表达量有差异:其在根、茎、叶和棉纤维等组织中呈微量表达;在生殖组织中随花蕾发育呈递增表达,同时在花药和胚珠中的表达量相对较高。此外,在花粉发育异常株系——胞质不育系P30A棉花中,其在小孢子败育阶段表达量明显低于正常可育系植株。这些结果表明GhSERK1基因可能在棉花生殖发育过程中,尤其是雄性生殖发育中发挥作用。为了进一步分析GhSERK1基因在棉花生长发育中的功能,本研究将分别含有GhSERK1基因的一个特异片段和两个同源片段的3个干扰载体转化棉花,并获得了转基因株系。根据荧光定量PCR结果发现,无论是转特异片段干扰载体的株系,还是转同源片段干扰载体的株系,与野生型相比,转基因株系中GhSERK1基因的表达量都减少了,其表达量仅为野生型的40%-1%不等;根据转基因植株的表型来看,它们的营养生长与野生型没有明显的差异,但雄蕊发育异常。其结果为:在转特异片段干扰载体的株系中,即只干扰GhSERK1基因本身,转基因植株除部分花药的花粉活力略有下降外,花药无明显差异;但在转SERK基因家族同源片段干扰载体的株系中,即干扰SERK基因家族中的多个基因,会影响花药的发育,出现花粉数量减少、花粉活力下降、部分花药有花粉但不开裂、甚至部分花药无花粉。这说明,棉花中的GhSERK1基因参与雄蕊发育,同时,推测棉花中SERK基因家族中可能不止一个成员参与了雄蕊发育,而且这些成员间有功能互补作用。 本论文获得了棉花中的SERK基因,并对GhSERK1基因的功能进行了研究,结果表明GhSERK1基因在棉花雄性生殖发育中起作用,同时可能参与棉花中多个生长发育过程。……   
[关键词]:体细胞胚发生受体类激酶(Somatic;embryogenesis;receptor-like;kinase;SERK);雄性发育;棉花;干扰载体
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国农业科学院2011年
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