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不同环境中木聚糖酶基因多样性分析及宏基因组来源的新基因克隆与表达

王国增

  木聚糖是植物细胞壁的主要组成成分,也是自然界中除纤维素之外第二丰富的再生资源。木聚糖的结构复杂,其完全降解需要多种酶的共同作用。木聚糖酶能够有效地降解木聚糖主链的β-1,4-糖苷键,是木聚糖降解中的关键酶。木聚糖酶广泛分布在微生物中,后者通过对木聚糖的降解利用而在自然界中的碳循环中起到很重要的作用。木聚糖酶在饲料、食品、造纸和生物能源等多个工业领域中也有着重要的应用价值而被广泛研究。现在获得的绝大部分的木聚糖酶都是来自分离纯化的微生物,而越来越多的实验表明环境微生物中绝大多数是未培养的。怎样发掘未培养微生物的基因资源,找到具有应用价值的木聚糖酶成为新的研究热点。 木聚糖酶主要划分在糖苷水解酶的第10和11家族。本研究通过对这两个家族的木聚糖酶蛋白序列的比对,确定了四个靠近活性中心或底物结合位点的保守区。基于一致-简并杂交寡核苷酸引物(CODEHOP)的3 简并5 保守的原理,设计了两套简并引物,X10-F/X10-R和X11-F/X11-R。该引物可从具有木聚糖降解能力的细菌和真菌代表菌株中高效扩增到目的基因片段,因此用于环境中木聚糖酶基因多样性的研究。 以雪莲根际土壤、冰川土壤、温泉高温土壤、菜园土、池塘底泥、和红树林土壤的宏基因组DNA为模板,以X10-F/X10-R或X11-F/X11-R为引物,分别从6个不同性质的土壤环境中扩增木聚糖酶基因片段。除温泉高温土壤中只能扩增到第10家族的木聚糖酶基因片段外,从其他土壤环境中都能扩增得到相应大小的两个家族木聚糖酶的基因片段(第10家族大约260 bp,第11家族210 bp左右)。将PCR产物纯化后连接载体转化构建了11个片段文库。从各个文库中随机挑选了共2115个阳性克隆,经测序及序列分析表明1075个序列是第10家族的木聚糖酶基因片段,684个序列是第11家族的木聚糖酶基因片段。经去冗余分析后,得到了490个相似性低于95%的特异基因片段,其中368个为第10家族的序列,122个第11家族的序列。序列比对分析表明75%的基因片段与已知序列相似性在80%以下,54%的序列与已知基因的相似性低于65%。该结果说明土壤环境中存在大量的木聚糖酶基因,且大部分具有很高的序列新颖性。通过进化,多样性和丰度的分析发现,6个环境中的木聚糖酶基因的分布和多样性都有很大的差别,而且各个环境中丰度较高的基因也不一样,说明不同环境中降解木聚糖的优势菌群存在显著差异。表明土壤环境中的木聚糖酶基因的分布和环境有很大的关系,而土壤环境因子(pH、含氧量、温度、有机质的含量等)可能是造成木聚糖酶基因的分布和多样性差异的主要原因。土壤环境来源的第10家族木聚糖酶绝大多数来源于细菌,而第11家族木聚糖酶序列中真菌来源的比细菌来源的要多。此外,土壤环境中第11家族的木聚糖酶的基因的多样性要远低于第10家族的。这种分布和多样性的不同暗示这两个糖苷水解酶家族在木聚糖的降解过程中可能发挥着不同的作用。 瘤胃内存在大量的微生物,是一个植物细胞壁多糖高效降解的环境。通过使用上述方法,从山羊瘤胃和绵羊瘤胃中一共获得了173个特异的木聚糖酶基因片段,其中107个片段为第10家族的木聚糖酶基因片段,其他属于第11家族。序列比对分析表明这些片段与已知木聚糖酶的相似性整体上要比土壤环境来源的相似性要低,说明瘤胃环境中存在大量的更为新颖的木聚糖酶。进一步的基因多样性,丰度和进化分析指出两大家族的木聚糖酶基因来源于不同的微生物,第10家族的木聚糖酶基因主要集中在非纤维素降解微生物,而第11家族的基因主要来源于纤维素降解微生物。该结果表明两个家族的木聚糖酶在瘤胃环境内木质纤维素降解过程中发挥的作用是不一样的。此外,不同瘤胃来源的木聚糖酶基因比较分析发现瘤胃中木聚糖降解微生物的分布是类似的,但也存在一定的差异。每个瘤胃环境中发挥主要木聚糖降解作用的菌物不同,且都存在特有的木聚糖降解微生物。而这种差异可能与宿主对微生物的选择有一定的关系。 基于10个山羊瘤胃环境来源的木聚糖酶基因片段序列,采用改进的TAIL-PCR方法,以山羊瘤胃宏基因组DNA为模板,最终获得了7个全长基因。其中,xynGR40,xynGR67,xynGR77,xynGR112和xynGR117编码的木聚糖酶属于第10家族,xynR8和xynR127编码第11家族的木聚糖酶。序列比对分析发现这些基因与已知基因的相似性为45–75%,表明这些基因都具有很高的新颖性。除XynR8无信号肽外,其它的蛋白都含有信号肽,可以分泌表达。通过结构域分析,发现XynGR40,XynGR77,XynGR117和XynR127是多结构域蛋白,而且其中的XynGR77和XynR127具有特殊的结构,这为以后的木聚糖酶的结构与功能研究提供了很好的实验材料。 其中的四个木聚糖酶基因xynGR40,xynGR67,xynR8和xynR127经原核表达后,重组酶进行了纯化和酶学性质分析。这四个酶的比活相对于大多数的木聚糖酶都高,这与瘤胃来源的酶具有相对较高的催化活性是一致的。它们的最适pH在5.5到6.5之间,与瘤胃液的pH(5.8)接近。最适温度差异很大,低至30°C (XynGR40),高至55°C (XynR8)。XynGR40有低温活性,在0°C还剩余10%的酶活。氨基酸的组成、盐桥和氢键的分析以及与嗜热酶在三维结构上的比较说明XynGR40是一个低温木聚糖酶。XynGR40是第一个从瘤胃环境中报道的低温木聚糖酶,它的特殊性质和结构为研究木聚糖酶的结构与功能的关系提供了很好的材料。同时,XynGR40在中温下的热稳定性、高比活、较好的抗离子能力以及产物简单等特性表明XynGR40在工业上有良好的应用前景。 总而言之,本研究建立了一个快速、有效的不需要微生物培养的分子生物学方法用于分析复杂环境中的木聚糖酶基因多样性。从特殊环境中获得了大量的新颖的木聚糖酶基因片段。结果表明这些木聚糖酶基因的分布和环境有很大的关系。基于部分片段序列,通过TAIL-PCR的改进方法,可以直接从环境宏基因组DNA中获得了木聚糖酶全长基因。本研究为环境中木聚糖酶的基因多样性和分布提供了一个新的视点,对理解它们在木聚糖自然降解很有意义,也为未培养微生物木聚糖酶基因资源的发掘提供了一个新的途径。……   
[关键词]:木聚糖;木聚糖酶;碳循环;基因多样性;未培养微生物;宏基因组学;基因克隆;表达
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国农业科学院2011年