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金雀异黄素对小鼠人肝癌HepG2细胞移植瘤的抑制作用及其机制的实验研究

吕春秀

  目的:通过实验研究金雀异黄素(Genistein)对肝癌细胞增殖抑制、诱导凋亡及相关蛋白表达的影响,探讨Genistein抗肝癌的作用机制,为肝癌治疗提供新的方法及理论依据。 方法:1体外实验:体外培养人肝癌细胞HepG2,采用四甲基偶氮唑蓝(tetrzolium-based colorimetric assay, MTT)比色法测定不同浓度Genistein作用于该细胞24h、48h、72h后对其增殖抑制作用;2体内实验:取健康雄性BALB/c小鼠(40只)称重,将HepG2细胞接种于小鼠右侧颈背部皮下,建立肝癌HepG2细胞小鼠模型。当全部小鼠可以触及到瘤体时,记录肿瘤体积。将小鼠按肿瘤体积编号,采用随机数字法将小鼠随机分为5组(每组8只):阴性对照组;Genistein低剂量组;Genistein中剂量组;Genistein高剂量组;5-氟尿嘧啶组(5-Fu),荷瘤成功后第二天开始采用腹腔注射给药方式给药:阴性对照组给予生理盐水(含二甲基亚砜DMSO<1%)0.2ml,每天给药一次,连续14天;实验组分别给予不同剂量的Genistein(5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg),方法同阴性对照组;5-Fu组给予5-Fu 0.2ml(16.5 mg/ml),每周给药一次,共两次。在给药期间观察小鼠一般情况,记录小鼠体重和肿瘤大小。所有小鼠在给药后第15天颈椎脱臼处死,剥瘤、称重,计算肿瘤体积和抑瘤率,应用流式细胞仪测定细胞周期分布及凋亡率。普通光学显微镜及透射电镜观察细胞形态学改变;应用免疫组化法检测移植瘤组织Survivin、Caspase-3蛋白的表达情况。 结果: 1体外实验结果 Genistein抑制HepG2细胞增殖:MTT检测结果显示:不同浓度Genistein对HepG2细胞增殖均有抑制作用。Genistein(10、20、30、40、60、80、120μg/ml)作用于HepG2细胞24h、48h、72h后检测, OD值均有不同程度下降,与阴性对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。各处理组间比较差异同样具有统计学意义(P<0.01),且伴随药物浓度的增加、作用时间的延长,抑制率逐渐升高,即表明Genistein对HepG2细胞增殖的抑制作用呈明显时间-剂量依赖效应。 2体内实验结果 2.1 Genistein明显抑制小鼠肿瘤的生长:各组小鼠处死后肿瘤体积的比较,Genistein低、中、高剂量组的肿瘤体积随着药物浓度的增加而逐渐减小,肿瘤体积(mm~3)分别为:189.625±85.590、126.000±42.050、73.000±34.034, 5-Fu组肿瘤体积(mm~3)为52.000±31.0333,均明显低于阴性对照组肿瘤体积(mm~3)326.875±178.922,差异有统计学意义(P<0.01),Genistein低、中、高剂量组与5-Fu组的瘤重明显低于阴性对照组,差异同样具有统计学意义(<0.01),Genistein低、中、高剂量组的抑瘤率随着药物浓度的增大而增加,分别为:8.70%、26.10%、40.15%。而5-Fu组的抑瘤率为55.40%,明显高于Genistein各剂量组。 2.2流式细胞术检测结果显示:Genistein低、中、高剂量组G2/M期细胞逐渐增多,G0/G1期细胞逐渐减少,该作用有剂量依赖性,与阴性对照组相比,差异均具有统计学意义(P<0.01),提示Genistein可阻滞细胞周期于G2/M期。Genistein低、中、高剂量组的凋亡百分率随着药物剂量的增加而逐渐升高,分别为:10.58±3.27%、19.63±1.29%、32.24±1.64%, 5-Fu组凋亡百分率为46.81±3.67%,均明显高于阴性对照组凋亡率2.09±0.69%,差异有统计学意义(P<0.01)。 2.3光镜下观察肝癌移植瘤组织细胞形态变化结果显示:阴性对照组肿瘤细胞分布密集,多成团状,细胞核增大,细胞质相应缩小,核分裂像多见。Genistein治疗组肿瘤细胞呈条索状排列或呈弥漫性分布,细胞大小不等,形态不规则,瘤组织内可见淋巴细胞浸润及不同程度的坏死。 2.4透射电镜下观察移植瘤组织超微结构改变:Genistein处理后的细胞呈现不同程度凋亡性改变:微绒毛减少,细胞体积变小,胞质致密,胞质中空泡化变性明显,粗面内质网有脱颗粒现象,核染色质高度浓缩,线粒体聚集,电子密度明显增高,边集于核膜下,形成沿核膜新月体状,呈凋亡细胞的特征性形态改变,有的出现核固缩、核碎裂。 2.5免疫组化检测结果显示:Survivin主要表达于细胞质,部分表达于细胞核,Caspase-3表达于细胞质,可见棕黄色着色。按照IHS值法进行免疫组化评分, Genistein低、中、高剂量组Survivin表达值(IHS值)随着药物剂量的增大而逐渐减小,Caspase-3表达值(IHS值)则随Genistein剂量的增大而逐渐增加。对于Survivin和Caspase-3这两种蛋白,各自比较其处理组和阴性对照组的IHS值,差异均有统计学意义(P<0.05)。 结论: 1 Genistein具有抑制肝癌HepG2细胞增殖的作用,并且具有时间-剂量依赖性。 2 Genistein对小鼠人肝癌HepG2细胞移植瘤具有抑制生长作用,并呈剂量依赖性。 3 Genistein可诱导小鼠人肝癌HepG2细胞移植瘤凋亡,阻滞细胞周期于G2/M期,该作用呈一定的剂量依赖性。 4 Genistein可诱导肝癌细胞凋亡,其机制可能与下调Survivin蛋白,上调Caspase-3蛋白的表达有关。 5 Genistein可抑制肝癌HepG2细胞增殖,并可诱导小鼠人肝癌HepG2细胞移植瘤凋亡,为肝癌治疗提供了新的理论依据。……   
[关键词]:金雀异黄素;肝癌HepG2细胞;移植瘤;增殖;凋亡;Survivin;Caspase-3
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:河北医科大学2011年
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