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加味达原饮对急性肝损伤湿邪内蕴证模型大鼠的治疗作用研究

赵冰洁

  目的: 在中医理论指导下,探讨大鼠湿邪内蕴证模型的造模过程及检测方法,为中医证型动物造模方法提供理论依据。并研究加味达原饮对D-GalN及CCL4所致的湿邪内蕴证急性肝损伤实验动物模型的治疗效果及作用机制。为中医治疗急性肝损伤提供科学依据。 方法: 选择加味达原饮对D-GalN及CCL4所致的湿邪内蕴证急性肝损伤大鼠模型进行干预,检测生化、免疫、病理、细胞通路等指标,研究达原饮治疗湿邪内蕴证肝损伤大鼠的机制及疗效。 实验一湿邪内蕴证动物模型的建立 SD大鼠,雌性,36只,随机分为空白对照组组、模型1组、模型2组,每组12只。模型1组使用“常规饮食+造模箱”造模。将大鼠置于温度28±2℃,湿度为90±5%的造模箱内饲养15天。造模2组使用“高脂高糖饮食+造模箱”造模。将大鼠置于温度28±2℃,湿度为90±5%的造模箱内饲养15天,并同时予高脂高糖饮食。测量大鼠的饮食量、饮水量、体重、SOD、MDA。 实验二加味达原饮治疗D-GalN所致急性肝损伤湿邪内蕴证大鼠的研究 SD大鼠,雌性,72只,随机分为空白对照组、模型组、阳性(美能)组、加味达原饮低、中、高剂量组,每组12只。除空白对照组外,余各组大鼠置于温度28±2℃,湿度90%±5%的造模箱内饲养15天,并同时给予高脂高糖饮食,15天后一次性腹腔注射D-GalN500mg/kg以造成急性肝损伤模型,造模后立即给予药物灌胃治疗,每日两次,其中阳性(美能)组的日给药量为15.75mg/kg/天,加味达原饮低、中、高剂量组的日给药量分别为:5.89g/kg/天、11.78g/kg/天和23.56g/kg/天。灌药体积为每次10ml/kg/次。造模48h后,所有大鼠股动脉采血,取血浆测ALT、AST、TB, ELISA法检测TNF-α、IL-1、IL-6,肝组织匀浆后荧光PCR法检测NF-κB有关信号传导通路的p65、p50蛋白的表达。处死动物,取肝右叶作常规HE切片,光镜下观察其变化。 实验三加味达原饮治疗CCL4所致急性肝损伤湿邪内蕴证大鼠的研究 SD大鼠,雌性,72只,随机分为空白对照组、模型组、阳性(美能)组、加味达原饮低、中、高剂量组,每组12只。除空白对照组外,余各组大鼠置于温度28±2℃,湿度90%±5%的造模箱内饲养15天,并同时给予高脂高糖饮食,15天后一次性腹腔注射CCL4原液lml/kg体重以造成急性肝损伤模型,造模后立即给予药物灌胃治疗,每日两次,其中阳性(美能)组的日给药量为15.75mg/kg/天,加味达原饮低、中、高剂量组的日给药量分别为:5.89g/kg/天、11.78g/kg/天和23.56g/kg/天。灌药体积为每次10ml/kg。造模48h后,所有大鼠股动脉采血,取血浆测ALT、AST、TB,比色法检测SOD、MDA, ELISA法检测TNF-α、IL-1、IL-6,肝组织匀浆后荧光PCR法检测|NF-κB相关信号传导通路的p65、p50蛋白的表达。处死动物,取肝右叶作常规HE切片,光镜下观察其变化。 结果: 1.湿热内蕴证动物模型的造模结果 造模后15天,模型1组饮食量、体重有明显的下降,与空白对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。饮水量与空白对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。SOD、MDA与空白对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。模型2组大鼠的饮食量、饮水量、体重、SOD明显下降,与空白对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。MDA明显升高,与空白对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。 2.加味达原饮对D-GaIN所致急性肝损伤湿邪内蕴证大鼠的治疗作用 (1)造模后48h,模型组ALT、AST、TB含量明显升高,与空白对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。阳性(美能)组,达原饮中、高剂量组ALT、AST、TB降低,与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05);加味达原饮低剂量组ALT下降,但与模型组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。 (2)造模后48h,模型组血浆TNF-α、IL-1、IL-6含量明显增高,与空白对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。阳性(美能)组、加味达原饮中、高剂量治疗组血浆TNF-α、IL-1、IL-6明显降低,与模型组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。低剂量组的TNF-α、IL-1、IL-6含量有所下降,但与模型组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。 (3)NF-κBp50, NF-κBp65 mRNA检测结果:模型组NF-κBp50, NF-κBp65 mRNA的表达明显增高,与空白对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。阳性(美能)组、加味达原饮中、高剂量治疗组NF-κB p50, NF-κBp65 mRNA表达明显降低,与模型组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。低剂量组NF-κBp50,NF-κBp65 mRNA表达与模型组比较,差异无统计学意义(P>0.05) (4)肝组织HE染色检测结果显示:空白对照组肝窦肝索结构清楚,肝细胞胞质丰富,核大而圆。模型组肝细胞片状坏死,或碎屑状坏死,肝细胞浊肿。加味达原饮低剂量组肝细胞广泛水肿,可见点状坏死和小灶区脂肪变性和点状肝细胞再生。阳性(美能)组,加味达原饮中、高剂量组肝细胞广泛浊肿,可见点状坏死。脂肪变性不明显。 3.加味达原饮对CCL4所致急性肝损伤湿邪内蕴证大鼠的治疗作用 (1)造模后48h,模型组ALT、AST、TB含量明显升高,与空白对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。阳性(美能)组,加味达原饮中、高剂量组ALT、AST、TB降低,与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05);加味达原饮低剂量组ALT下降,与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05) (2)造模后48h,模型组SOD降低,MDA升高,与空白对照组比较有统计学意义(P<0.05)。阳性(美能)组、加味达原饮中、高剂量组的SOD升高,MDA下降,与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05);加味达原饮低剂量组SOD升高,但与模型组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。 (3)造模后48h,模型组血浆TNF-α、IL-1、IL-6含量明显增高,与空白对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。加味达原饮中、高剂量组的TNF-α下降,与模型组相比有统计学意义(P<0.05)。阳性(美能)组、加味达原饮高剂量组IL-6下降,与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。 (4)NF-κBp50, NF-κBp65 mRNA检测结果:模型组NF-κBp50,NF-κBp65 mRNA的表达明显增高,与空白对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。阳性(美能)组、加味达原饮中、高剂量治疗组NF-κBp50,NF-κBp65 mRNA表达明显降低,与模型组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。低剂量组NF-κBp50,NF-κBp65 mRNA表达与模型组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。 (5)肝组织HE染色检测结果显示:空白对照组肝窦肝索结构清楚,肝细胞胞质丰富,核大而圆。模型组肝细胞点状坏死,有广泛的肝细胞水肿,明显脂肪变性。加味达原饮低剂量组可见肝细胞部分水肿,脂肪变性和灶区肝细胞再生。阳性(美能)组,加味达原饮中、高剂量组见肝细胞水肿,点状肝细胞再生,肝细胞脂肪变性较模型组轻。 结论 1.“高脂高糖饮食+造模箱”和“常规饮食+造模箱”都可造成湿邪内蕴证动物模型。且造成的大鼠模型偏于湿热内蕴证。造模后大鼠的行动、体重、饮食量、饮水量都有明显改变。但“高脂高糖饮食+造模箱”造模方法的效果更显著,造模后大鼠不仅一般表现发生明显改变,且测量后显示SOD、MDA发生改变。这与中医的内外因致病的理论相一致。 2.加味达原饮中、高剂量治疗组均能显著减轻D-GalN所致湿邪内蕴证大鼠的肝细胞损伤,降低血浆中ALT、AST、TB含量,具有较好的保肝降酶作用。加味达原饮中、高剂量治疗组能显著改善急性肝损伤湿邪内蕴证大鼠肝组织的病理变化,缩小病变面积,减轻肝细胞病变程度。并可降低机体一系列的细胞因子,通过调节机体的免疫反应而起到保肝作用。加味达原饮低剂量组也有一定的保肝降酶作用,但其各指标结果之间差异较大,效果较难评价。 3.加味达原饮的中、高剂量组可明显减轻CCL4所致湿邪内蕴证大鼠的肝细胞损伤,降低血浆中ALT、AST、TB含量,具有较好的保肝降酶作用。并可对SOD、MDA及TNF-α、IL-1、IL-6等细胞因子起到调节作用,并可调节NF-κBp50,NF-κBp65的表达,通过抑制机体的脂质过氧化反应、免疫调节等多重功效而发挥保肝作用。加味达原饮低剂量组保肝作用不明显。……   
[关键词]:加味达原饮;急性肝损伤;湿邪内蕴证模型;NF-κBp50;NF-κbp65
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:成都中医药大学2011年