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KGF-2生物蛋白复合海绵的制备及其稳定性研究

蔡敏倩

  角质细胞生长因子-2(KGF-2)在损伤修复等很多方面都发挥着很重要的作用,但是KGF-2的应用受到自身生物学特性和外界环境的影响相当大,在体内应用时蛋白的稳定性和生物活性不容易保持,比如37℃时在磷酸盐缓冲液或生理盐水中KGF-2的活性还维持不到1h,不能有效发挥其生物学功能。因此需要有效的生长因子缓释传输途径解决这一问题,而理想的缓释载体是关键。 生物蛋白海绵具有优良的生物相容性、生物可降解性、止血性、可吸收性和缓释性,并可在温和的条件下加工成各种形状的载体。其能够与生长因子以一种简单、可靠的方式可逆性结合,即固定生长因子,有效保持生长因子活性和缓慢控制释放,发挥其促血管生成、创伤修复、抑制疤痕形成等效应。 本研究设计利用生物蛋白海绵作为KGF-2的缓释载体,一方面可以使KGF-2的半衰期延长,在体内发挥有效作用的时间也相应延长,从而能更好的发挥其作用;另一方面,生物蛋白海绵复合KGF-2,并不会影响生物蛋白海绵发挥其自身的优势,从而使两者均能很好的发挥作用。 目的:制备出KGF-2生物蛋白复合海绵,建立对KGF-2生物蛋白复合海绵体外生物学活性测定的方法,测定KGF-2生物蛋白复合海绵的稳定性及KGF-2的缓释情况。 方法:本研究在酸性条件下利用酶解法以猪皮为原料制得胶原蛋白溶液,并通过蛋白电泳分析、紫外分光光度分析、紫外吸收法、凯氏定氮法对其进行鉴定和浓度的测定后,-80℃冷冻保存,冷冻干燥制成胶原蛋白海绵和KGF-2生物蛋白复合海绵。再分别对其进行生物相容性、理化性质和体外生物学活性的检测。采用细胞活性实验对KGF-2生物蛋白复合海绵的稳定性进行考察,利用ELISA试剂盒计算出KGF-2从生物蛋白复合海绵中释放随时间变化的情况,从而了解到KGF-2从KGF-2生物蛋白复合海绵中缓慢释放的情况。 结果表明:SDS-PAGE凝胶电泳图表明提取的胶原纯度比较高,紫外分光光度法分析表明胃蛋白酶提取猪皮胶原的紫外最大吸收在231.8nm左右波长处,符合胶原蛋白的特性。测定胶原蛋白溶液浓度为4.507mg/ml。经冻干后成胶原蛋白海绵,细胞在其上生长状况良好,这表明材料的生物相容性好。KGF-2生物蛋白复合海绵的外观、表面结构、表观密度、pH值、含水量、润湿时间、吸液性、吸水率、孔隙率测定等理化指标与胶原蛋白海绵比较均没有显著性差异,说明在生物蛋白海绵中加入KGF-2并不会改变海绵的理化性能;电泳检查结果表明KGF-2生物蛋白复合海绵在约20 kD处具有明显的条带。通过SEM观察,胶原蛋白海绵组和KGF-2生物蛋白复合海绵组在总的形貌上无显著性差异。体外生物学活性表明,KGF-2生物蛋白复合海绵、KGF-2原液对体外培养NIH3T3细胞具有一定的促增殖作用,与PBS对照组比较具有显著性差异(P<0.01,P<0.05);胶原蛋白海绵也可以促进NIH3T3细胞的增殖,与PBS对照组比较无显著性差异(P>0.05)。KGF-2生物蛋白复合海绵在25℃和37℃的条件下保存6个月活性变化均没有显著性差异(P>0.05),表明其稳定性良好。最后缓释实验表明制备出的KGF-2生物蛋白复合海绵缓释周期较长,在14d时释放约为51.33±0.32%。 结论:成功的制备出KGF-2生物蛋白复合海绵,其理化性质、体外生物学活性和稳定性的检测结果良好,KGF-2生物蛋白复合海绵缓释周期较长。……   
[关键词]:KGF-2生物蛋白复合海绵;生物相容性;稳定性;缓释
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:吉林农业大学2011年